Purification and Antioxidant Properties of Anthocyanins from Jingle Lycium ruthenicum
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摘要: 目的：探讨静乐黑枸杞花青素的纯化工艺及其抗氧化活性。方法：比较HPD100、D101、NKA、AB-8、HPD400等五种树脂对静乐黑枸杞花青素的吸附与解析性能，筛选最佳树脂，并优化其纯化条件；采用DPPH自由基、OH自由基和ABTS自由基法，比较黑枸杞样品纯化前后的抗氧化活性。结果：HPD100大孔树脂对于静乐黑枸杞花青素有良好的纯化性能，适宜的工艺条件为：静乐黑枸杞粗提液上样浓度为0.2 mg/mL（含生药量）、上样体积为49 mL、洗脱剂为75%的乙醇溶液、洗脱剂用量42 mL，在此条件下，纯化后花青素的纯度由2.38%提高至17.82%。静乐黑枸杞具有较好的抗氧化能力，其粗提液和纯化液清除DPPH·的IC50 值分别为0.208 和0.011 mg/mL；对ABTS+·清除能力的IC50 值分别为0.476 和0.064 mg/mL；纯化液清除·OH 的IC50 值为6.24 mg/mL。结论：大孔树脂吸附法分离纯化静乐黑枸杞花青素工艺合理，且纯化后抗氧化活性明显提高。Abstract: Objective: To investigate the purification technology and antioxidation ability of Lycium ruthenicum anthocyanins from Jingle. Methods: Based on the adsorption properties of selected five macroporous resins (HPD100、D101、NKA、AB-8、HPD400) for Lycium ruthenicum anthocyanins from Jingle, the optimum purification resins were screened and the purification parameters were optimized. The antioxidant activity of crude and purified Lycium ruthenicum anthocyanins from Jingle were investigated by DPPH, hydroxyl and ABTS free radical scavenging assay. Results: HPD100 resin had good separation and purification effect. The optimum purification parameters were as follows: Sample concentration 0.2 mg/mL, sample volume 49 mL, elution volume 42 mL with 75% ethanol. After purification, the anthocyanins content was from 2.38% to17.82%. The crude and purified Lycium ruthenicum anthocyanins from Jingle showed good antioxidant activity, the IC50 values of DPPH· scavenging capacity were 0.208 and 0.011 mg/mL respectively, the IC50 values of ABTS+· scavenging capacity were 0.476 and 0.064 mg/mL respectively, the IC50 value of purified Lycium ruthenicum anthocyanins for ·OH scavenging capacity was 6.24 mg/mL. Conclusion: The macroporous resin method for purifying Lycium ruthenicum anthocyanins has good purification effect. The antioxidant capacity of the purified Lycium ruthenicum anthocyanins was significantly improved compared with the crude extracts.
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Keywords:
- Lycium ruthenicum /
- anthocyanins /
- macroporous resins /
- purification /
- antioxidant
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花青素，又称花色素，是存在于自然界深色植物中的一类水溶性黄酮类化合物，具有抗衰老、保护心血管、抗炎、抗氧化、预防癌症等药理作用[1]。茄科枸杞属多棘刺灌木黑枸杞，含有较丰富的花青素。现代药理研究表明，黑枸杞花青素具有降糖、降脂、保护神经、提高记忆力、抗炎、抗氧化、防辐射、治疗肠炎、治疗非酒精性脂肪肝炎等作用[2-8]。因此，黑枸杞花青素的开发具有较大的研究价值和应用前景。
大孔吸附树脂具有化学稳定、吸附容量大、选择性良好、操作条件简单等优点，被广泛应用于花青素、多酚、黄酮等天然活性化合物的分离和纯化[9-11]。赵文娟等[12]采用D101树脂对黑果枸杞（新疆产）的原花青素进行了分离纯化，纯化后样品含量增加了2.17倍；吕玉姣等[13]采用HP-2MGL型树脂对黑果枸杞（新疆产）的花青素进行了分离纯化，纯化后样品含量增加了3.07倍；顾子扬等[14]采用Amberlite XAD-7HP型树脂对黑枸杞（青海产）的花青素进行了分离纯化，纯化后样品峰面积均明显增加，但未见对2012年山西静乐县引进试种的黑枸杞[15]中的花青素的研究报道。因此，本文以静乐黑枸杞[16]为研究对象，考察国产5种大孔吸附树脂（型号分别为HPD100、D101、NKA、AB-8、HPD400）对黑枸杞花青素的吸附和解析性能，筛选最佳树脂，并确定最佳分离纯化工艺，同时测定粗提物和纯化产物对DPPH·、·OH和ABTS+·的清除能力，以期为山西静乐县黑枸杞的进一步开发加工提供实验依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
黑枸杞的成熟干燥果实 山西静乐县，粉碎，过40目筛；HPD100大孔树脂 东鸿化工有限公司；D101、NKA大孔树脂 陕西乐博生化科技有限公司；AB-8、HPD400大孔树脂 陕西乐博生化科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） 东京化成工业株式会社；总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS法） 碧云天生物科技有限公司；水 蒸馏水；其余试剂 均为分析纯。
RE-3000A型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；Ph-610型pH计 Wiggens公司；ZXY-48型气浴恒温振荡器 常州润华电器有限公司；6100S型紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；Scientz-N型真空冷冻干燥机 宁波新芝生物科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 黑枸杞花青素的提取
称取静乐黑枸杞粉末适量，精密称定，加入50%乙醇（10倍量），45 ℃超声0.5 h，过滤，取上清液，重复两次，合并三次提取的上清液，减压浓缩除去乙醇，冷冻干燥，置于4 ℃冰箱保存，备用。临用前加适量水全部溶解得黑枸杞粗提液。
1.2.2 黑枸杞花青素得率的测定
采用pH示差法[17]，按下式计算花青素浓度：
花青素浓度（mg/mL）=∆A×MW×DF/ε
∆A=（AλpH1.0−A700pH1.0）−（AλpH4.5−A700pH4.5）
式中：A-吸光度；λ-最大吸收波长；DF-稀释倍数；ε-矢车菊花青素-3-葡萄糖苷的消光系数，26900；MW（分子量），449.2。
1.2.3 黑枸杞花青素的纯化
1.2.3.1 大孔树脂的预处理
无水乙醇浸泡大孔树脂 24 h 后，无水乙醇反复洗涤至乙醇液与等体积的水混合不产生白色浑浊时，用水洗至无醇味；再5%NaOH浸泡大孔树脂12 h后，水洗至中性；最后用5%HCL浸泡大孔树脂12 h后，水洗至中性，备用[11-12]。
1.2.3.2 最佳树脂的筛选
a. 静态吸附试验：称取已处理好的 HPD100、D101、NKA、AB-8、HPD400 型树脂各3.00 g，各加入30 mL黑枸杞花青素提取液（含生药0.1 mg/mL），置气浴恒温振荡器（25 ℃，120 r/min）中振荡吸附24 h，采用pH示差法测定原液和吸附液中黑枸杞花青素的含量，计算公式如下：
吸附率（%）=（C0−C1）/C0×100
吸附量（mg/g）=（C0−C1）×V/m
式中：C0和C1分别为原液和吸附后溶液中花青素的浓度（mg/ mL）；V：加入体积（mL）；m：树脂量（g）。
b. 动态吸附试验：称取5种型号的大孔树脂各5.00 g，湿法装柱（柱径×柱长：2.0 cm×30.0 cm），分别将50 mL黑枸杞提取液（含生药0.1 mg/mL）以相同流速4 BV（bed volume，柱床体积，7 mL）/h通过各型号树脂，采用pH示差法测定吸附液中花青素的浓度，计算树脂的吸附量，计算同静态吸附法。将上述已吸附的大孔树脂先用4 BV的纯化水水洗除杂，再用4 BV的75%乙醇洗脱，采用pH示差法测定解析液中花青素的含量，解吸率计算如下：
吸附量（mg/g）=（m0−m1）/m
吸附率（%）=（m0−m1）/m0×100
解吸率（%）=m2/（m0−m1）×100
式中，m0、m1和m2分别为原液、吸附液、解吸液中花青素的质量（mg）；m为树脂的质量（g）。
1.2.3.3 树脂动态吸附-解吸试验
a. 上样质量浓度的确定：将50 mL不同浓度的黑枸杞提取液（含生药0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5 g/mL）以相同流速（4 BV/h）通过树脂柱，动态吸附后，采用pH示差法测定吸附液中花青素的浓度，计算其吸附率。
b. 上样体积的确定：将黑枸杞提取液（0.2 g/mL）以4 BV/h的流速注入树脂柱中，同时收集吸附液（7 mL/管）。采用pH示差法测定吸附液中花青素的浓度，绘制泄露曲线，确定最佳的上样体积。
c. 解析液浓度的确定：将49 mL黑枸杞提取液（浓度为0.2 g/mL），加入树脂柱中，以4 BV/h的流速进行吸附，采用pH示差法测定吸附液中花青素的浓度，计算吸附率。分别用浓度为30%、45%、60%、75%和90%的乙醇溶液以4 BV/h的流速洗脱，收集解析液，采用pH示差法测定解析液中花青素的浓度，计算解吸率。
d. 洗脱剂用量的确定：将49 mL黑枸杞提取液（浓度为0.2 g/mL），加入树脂柱中，以4 BV/h的流速进行吸附，再用75%乙醇洗脱，洗脱速度为4 BV/h，采用pH示差法测定解析液中花青素的浓度，绘制洗脱曲线。
1.2.4 黑枸杞花青素体外抗氧化活性测定
1.2.4.1 DPPH·清除能力测定
取2 mL的DPPH溶液（浓度约为0.05 mg/mL），加入等量的黑枸杞粗提液或纯化液，混匀，暗处反应0.5 h，于分光光度计515 nm处测量，测得值为As，控制样本用2 mL无水乙醇代替提取物，测得值为A0。黑枸杞粗提液或纯化液对DPPH·的清除率[18] S（%）=（A0−As）/A0 × 100，并计算IC50值。
1.2.4.2 ·OH清除能力测定
精密吸取PBS溶液2.0 mL，邻二氮菲溶液（7.5 mmol/L）0.2 mL，硫酸亚铁溶液（7.5 mmol/L）0.2 mL，样品液0.4 mL，双氧水溶液（1%）0.4 mL，水 3.8 mL，配置好后37 ℃水浴加热1 h，于分光光度计510 nm处测定，测得值为A样；以水代替双氧水和样品测得值为A空；以水代替样品液测得值为A损。黑枸杞粗提液或纯化液对·OH的清除率[19] S（%）=（A样−A损）/（A空−A损）× 100，并计算IC50值。
1.2.4.3 ABTS+·清除能力的测定
在96孔板中，每孔加入ABTS工作液200 μL，黑枸杞粗提液或纯化液10 μL，混匀，静置5 min（避光），734 nm处测定吸光度值OD样品，以空白溶剂代替样品液测得值为OD0。黑枸杞提取物对ABTS+·的清除率[20-21]S（%）=（OD0−OD样品）/OD0×100%，并计算IC50值。
1.3 数据处理
所有试验均重复三次，取平均值±标准差。使用GraphPad Prism 5.0 进行数据统计分析和绘制图表。
2. 结果与分析
2.1 最佳树脂的筛选试验结果
2.1.1 大孔树脂对黑枸杞花青素的静态吸附效果
由图1可知，五种大孔树脂对黑枸杞花青素的静态吸附量和吸附率的的差别不明显，都可作为筛选对象。
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图 1 不同树脂对黑枸杞花青素的静态吸附结果Figure 1. Results of static adsorption of Lycium ruthenicum anthocyanins by different resins2.1.2 大孔树脂对黑枸杞花青素的动态吸附与解吸效果
由图2可知，五种树脂对于黑枸杞花青素的吸附率基本一致，无显著性差异，除AB-8的解析率偏低外，其余四种树脂解析率基本一致，无显著性差异（P>0.05），因此，除AB-8的其余四种树脂均可作为筛选对象，结合实验室条件，本次实验选用树脂HPD100。
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图 2 不同树脂对黑枸杞花青素的动态吸附和解析结果Figure 2. Results of dynamic adsorption and desorption of Lycium ruthenicum anthocyanins by different resins2.1.3 树脂动态吸附-解吸试验结果
2.1.3.1 上样质量浓度对吸附率的影响
由图3可知，黑枸杞生药浓度由0.025 g/mL增加至0.2 g/mL时，其吸附率逐渐增加且趋于平缓，其原因可能是浓度增加有利于花青素分子与树脂的接触面积；但浓度大于0.2 mg/mL时，吸附率反而降低，其原因可能是浓度过高时溶液中杂质含量增多，增加了杂质与花青素对树脂的竞争，吸附率下降。因此，最好选择浓度0.2 g/mL作为HPD100树脂纯化黑枸杞花青素时的初始上样浓度。
2.1.3.2 上样体积对树脂吸附性能的影响
由图4可知，随上样量增加，流出液中黑枸杞花青素浓度增加，即HPD100树脂对花青素的吸附效果随上样量的增加而下降。达到7 BV时，花青素出现明显泄漏，泄露总量为上样量5%时，认为已经出现泄露，此时花青素与树脂的结合基本达到饱和，因此确定上样体积为7 BV，相当于49 mL。
2.1.3.3 乙醇浓度对树脂解析效果的影响
由图5可知，随着乙醇浓度增大（30%～75%），解吸率也随之增加，当乙醇浓度为75%时，解吸率达到最高92.3%，而乙醇浓度继续增大时，洗脱能力反而减弱，根据相似相溶的原理，可知75%乙醇有利于花青素的解吸附，乙醇浓度过低或过高时，可能会影响花青素和大孔树脂之间的相互作用，故选用75%乙醇作为洗脱溶剂。
2.1.3.4 洗脱溶剂（75%乙醇）用量对树脂吸附性能的影响
由图6可知，随着洗脱溶剂用量的增加，洗脱剂中花青素的浓度呈先增加后降低的趋势；当洗脱剂用量为6 BV时，黑枸杞花青素基本被洗脱，继续增加洗脱剂用量，仍有花青素洗脱下来，但浓度很低。从成本方面考虑，选用6 BV的洗脱剂用量。
将处理好的HPD100树脂湿法装柱，按上述最优条件，对黑枸杞粗提液进行分离纯化，纯化液浓缩后冷冻干燥，备用。采用pH示差法测定花青素的含量，结果表明，黑枸杞粗提物中花青素的纯度为2.38%，纯化后黑枸杞花青素纯度为17.82%，由此可知，经HPD100树脂纯化后，花青素的纯度提高至原来的7.49倍，说明此方法纯化效果良好。
2.2 纯化对黑枸杞花青素抗氧化活性的影响
2.2.1 DPPH·清除能力
脂溶性DPPH·是一种稳定的以N为中心的自由基，其清除能力可以用来表征物质的抗氧化能力[22-23]。物质对DPPH·的清除率越高，表明其抗氧化能力越强，防止脂质过氧化能力越强[23]。由图7可知，黑枸杞粗提液（未纯化）和纯化后的黑枸杞样品的浓度分别在0.08～0.24 和0.003～0.024 mg/mL时，其清除DPPH·的能力与其浓度存在明显的量效关系，且呈现出良好的线性关系，由此可计算未纯化和纯化黑枸杞花青素对DPPH·的半数清除浓度（IC50）分别为0.208和0.011 mg/mL。由此可知，纯化后的黑枸杞样品对DPPH·的清除能力约是黑枸杞粗提液（未纯化）的18.9倍，表明纯化后的黑枸杞样品抗氧化能力明显增强。黑枸杞粗提液（未纯化）清除DPPH·的能力与文献[24]报道基本一致，但文献未考察黑枸杞样品的纯化及纯化后对DPPH·的清除能力。
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图 7 样液浓度对DPPH·的清除率（n=3）Figure 7. Scavenging ratio of sample concentration on DPPH free radical (n=3)2.2.2 ·OH清除能力测定
·OH可引起DNA、细胞膜等生物大分子降解，从而破环细胞的完整性，是公认的毒性最大的自由基[24-25]。由图8可知，纯化后黑枸杞样品的浓度在2.4～8.4 mg/mL时，对·OH的清除能力与其浓度存在明显的量效关系，且呈现出良好的线性关系，由此可计算其对·OH的IC50为6.24 mg/mL。黑枸杞粗提液（未纯化）在2.4～8.4 mg/mL范围内抗氧化呈一定线性关系，但浓度大于7.2 mg/mL时对·OH的清除率不再增加，趋于平缓，在浓度为8.4 mg/mL时，最大清除率仅为38.3%，由此可知，纯化后的黑枸杞样品对·OH的清除率明显增高，抗氧化能力明显增强，保护细胞的能力增强。黑枸杞粗提液（未纯化）与文献[24]中黑枸杞回流提取液的·OH清除率基本一致，但样品浓度有差异，这与·OH清除率的测定方法不一致有关，本文采用的是邻二氮菲-Fe2+氧化法，而文献[24]用的是水杨酸法，二者反应机理不同[24]。
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图 8 样液浓度对·OH的清除率（n=3）Figure 8. Scavenging ratio of sample concentration on ·OH radical (n=3)2.2.3 ABTS+·清除率的测定
水溶性ABTS+·是一种稳定的绿色自由基，物质对其清除率的能力可以用来表征该物质的总抗氧化能力[22,26]。由图9可知，黑枸杞粗提液（未纯化）和纯化后的黑枸杞样品分别在0.1～1.0 和0.01～0.1 mg/mL范围时，对ABTS+·的清除能力与其浓度存在明显的量效关系，且呈现出良好的线性关系，由此可计算其对ABTS+·的IC50分别为0.476和0.064 mg/mL。由此可知，纯化后的黑枸杞样品对ABTS+·的清除能力约是黑枸杞粗提液（未纯化）的7.44倍，表明纯化后的黑枸杞样品抗氧化能力增强，与文献[14]报道的抗氧化能力增强倍数有所差异，这可能与文献中用的是没食子酸当量浓度的计算方法有关。
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图 9 样液浓度对ABTS+·的清除率（n=3）Figure 9. Scavenging ratio of sample concentration on ABTS free radical (n=3)3. 结论
以2012年山西静乐县引进试种的黑枸杞为研究对象，通过试验研究了六种大孔树脂对黑枸杞花青素纯化效果的影响，选用HPD100树脂作为本实验的筛选对象，当样液初始浓度为0.2 mg/mL、上样体积为49 mL（7 BV）、洗脱剂乙醇浓度为75%、洗脱剂用量为42 mL（6 BV）时，黑枸杞花青素纯度由2.38%上升到17.82%，提高了7.49倍。分别以DPPH·、·OH和ABTS+·清除法测定黑枸杞提取液纯化前后的自由基清除能力，结果表明黑枸杞粗提液和纯化液DPPH·清除能力的IC50 值分别为0.208和0.011 mg/mL；对ABTS+·清除能力的IC50 值分别为0.476和0.064 mg/mL；黑枸杞粗提液对·OH的最大清除率为38.3%，纯化液对·OH的清除能力IC50为6.24 mg/mL；表明经纯化后黑枸杞花青素的抗氧化能力较纯化前有了显著提高。纯化后黑枸杞花青素较强的抗氧化性，故可以作为天然抗氧化剂，且无毒副作用，这对山西静乐县黑枸杞的综合开发利用具有重要意义。
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图 1 不同树脂对黑枸杞花青素的静态吸附结果
Figure 1. Results of static adsorption of Lycium ruthenicum anthocyanins by different resins
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图 2 不同树脂对黑枸杞花青素的动态吸附和解析结果
Figure 2. Results of dynamic adsorption and desorption of Lycium ruthenicum anthocyanins by different resins
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图 7 样液浓度对DPPH·的清除率（n=3）
Figure 7. Scavenging ratio of sample concentration on DPPH free radical (n=3)
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图 8 样液浓度对·OH的清除率（n=3）
Figure 8. Scavenging ratio of sample concentration on ·OH radical (n=3)
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