Study on Microbial Diversity in Milk of Yak and Cattle-Yak in Qinghai-Tibet Plateau Based on High-throughput Sequencing Technology
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摘要: 为探究牦牛和犏牛生鲜乳中微生物的组成和多样性，采用高通量测序技术分析两种生鲜乳的16S rDNA V4区域，并进行生物信息学对比分析。结果显示：97%的一致性共得到5516个OTUs，微生物门水平的比较表明变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）及放线菌门（Actinobacteria）为牦牛乳和犏牛乳共同的优势菌门，牦牛乳三种微生物的相对丰度分别为29.80%、35.99%及8.41%，犏牛乳为45.36%、25.79%及7.39%；在属水平上，牦牛乳的优势菌属为未分类的蓝藻细菌属（unidentified-Cyanobacteria），相对丰度为9.32%，犏牛乳的优势菌属为慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium），所占比例为11.53%；在种水平上，埃尔坎尼中慢生根瘤菌种（Bradyrhizobium elkanii）和Kosakonia oryzae为牦牛乳和犏牛乳中共有的优势菌种，两种菌种在牦牛乳中分别占比2.42%、3.36%，在犏牛乳中分别占比11.53%、5.53%；Alpha多样性分析表明不同牛乳丰度估计值存在显著差异（P<0.05），且犏牛乳的丰富度及多样性较高。Abstract: This study aimed to explore the composition and diversity of microorganisms in raw milk of yak and cattle-yak. The 16S rDNA V4 region of those two kinds of raw milk was sequencing by high-throughput technology and comparative analysis of bioinformatics.The results showed that a total of 5516 OTUs were obtained with 97% similarity level.The comparison of microbial phylum levels shows that Proteobacteria, Firmicutes and Actinobacteria were the common dominant bacteria phylum for yak milk and cattle-yak milk.The relative abundances of the three Microbes in the yak milk were 29.80%, 35.99% and 8.41%, respectively. The relative abundances of the three microbes in the cattle-yakmilk were 45.36%, 25.79% and 7.39%, respectively. At the genus level, the dominant genus of yak milk was unidentified-Cyanobacteria, and the relative abundance was 9.32%. The dominant genus of cattle-yak milk was Bradyrhizobium, which accounts for 11.53%. At the species level, Bradyrhizobium elkanii and Kosakonia oryzae were the dominant strains in milk of yak and cattle-yak. The two strains accounted for 2.42% and 3.36% in yak milk, respectively.And the two types of bacteria account for 11.53% and 5.53% of the milk in the cattle-yak, respectively. Alpha diversity analysis shows that there are significant differences between different milk richness estimates (P<0.05).And the richness and diversity ofcattle-yak milk was higher.
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Keywords:
- yak milk /
- yak-cattlle milk /
- microbial diversity /
- 16S rDNA
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青藏高原及其毗邻地区的牦牛是当地牧民生产生活及畜牧经济主要的畜种之一，能很好地适应高海拔缺氧的环境并为人类提供乳、肉和运输等基本资源[1]。牦牛乳被称为天然浓缩乳，所含的营养物质如蛋白质、脂肪、必需氨基酸、矿物质（磷除外）大多均高于其他牛乳[2-4]。牦牛与奶（肉）牛的F1后代为犏牛[5]，具有杂种优势，适应性更强，且母犏牛比母牦牛的乳产量高。同时有研究发现虽然牦牛乳和犏牛乳都具有丰富的脂肪酸，犏牛乳具有高端牛奶的资源优势，乳质优良，气味芬芳，营养丰富[6-8]。牛乳作为人类饮食生活的重要组成成分，几乎适合所有年龄段的人食用，乳中丰富的微生物区系与人类健康密切相关，一些微生物可能会降低炎性肠病，腹泻，便秘，食物过敏甚至结肠癌的发病率[9]。牛乳除了含有多种对机体健康有益的微生物之外，还存在一些对人类健康有威胁的致病菌如：李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌等[10]。
随着科学技术的发展，牛乳微生物组成的神秘面纱被逐渐揭开。早期研究中，采用传统的美兰实验法对牦牛乳微生物的含量有了初步的了解[11]。此外，肜豪峰等[12]采用稀释平板涂布法分离计数对牦牛乳及其制品中微生物区系进行了分析。微生物在极端环境下经过长期的自然选择，具备相对特殊的结构、机能以及遗传特性[13-14]。其群落结构组成不仅受环境差异影响还和来源动物有关，宿主动物的来源不同直接影响着乳微生物群落结构组成[15]。已知犏牛乳品质的杂种优势，但其微生物组成及种类还不清楚。因此，开展牦牛乳和犏牛乳中的微生物组的研究非常必要。
近年来越来越多的证据表明，高通量测序技术可以克服基于微生物培养的检测方法的局限性，因此被用来快速鉴定微生物和发现新微生物[16-17]，广泛的用于各个领域。如16S rDNA来检测食品中的微生物群落结构及鉴定绵羊粪便微生物群的多样性和功能[18-19]。综上所述，牦牛乳和犏牛乳作为青藏高原特色乳其营养价值较高，但目前对两种原乳微生物结构组成差异及优势菌群了解较少，因此本试验通过提取牦牛乳和犏牛乳中微生物的DNA进行高通量测序，更加全面的展现了牦牛和犏牛乳微生物组成差异及多样性，以期为牦牛乳及犏牛乳制品的开发利用及优势菌群的发掘等提供基础依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
牛乳样品采集信息 采样时间：2019年7月至8月。采样地点：在青海省贵南县塔秀乡达隆村夏曲骏周太畜牧业专业合作社。选取自然放牧状态下全天候随群放牧的未进行任何补饲的体况一致的泌乳中期4～5胎次的健康牦牛（yak）和犏牛（dzo）各5头，每头各采3份，共采生鲜牦牛乳15份，生鲜犏牛乳15份，两种生鲜乳各五组，一组因污染剔除，牦牛乳和犏牛乳各剩四组（yak5.2,yak5.6,yak5.7,yak5.10;dzo16.2,dzo16.6,dzo16.7,dzo16.10），每组乳样取50 mL，分为两部分：取45 mL至离心管（康宁/Corning公司）中，干冰速冻后于−20 °C冰箱储存，用于乳常规营养成分分析。取5 mL于无菌无酶冻存管（康宁/Corning公司）中，液氮速冻后运回实验室−80 °C冰箱储存，用于测定微生物多样性及组成。
FOSS多功能乳制品分析仪（MilkoScan FT1） 上海瑞玢国际贸易有限公司；DCC体细胞检测仪 利拉伐天津有限公司；超低温冰箱（−80 ℃） 美国Thermo公司；Fresco21型高速冷冻离心机 美国Thermo公司；Tprofessiona PCR仪 德国Biometral公司；Gel DOC XR凝胶成像系统、PowerPacUniversal水平电泳仪、SUBCELL GT电泳槽（20 cm×25 cm） 美国Bio-Rad公司。
1.2 实验方法
1.2.1 牦牛乳和犏牛乳常规营养成分分析
采用FOSS FT-1乳品分析仪测定牦牛乳和犏牛乳常规营养成分。
1.2.2 基因组总DNA提取及PCR扩增、测序
采用SDS法提取基因组总DNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，并用无菌水将其稀释至1 ng/μL作为PCR模板，使用带 Barcode 的特异性引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′），New England Biolabs公司的Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer及高效高保真酶对特定区域进行PCR扩增。扩增条件：95 ℃预变性2 min后，95 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环，72 ℃延伸5 min。
所得PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，对目的条带使用Qiagen公司提供的胶回收试剂盒（MinElute Gel Extraction Kit）回收产物。然后使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量，使用NovaSeq6000进行上机测序。PCR扩增、PCR产物的混样、纯化，文库的构建和上机测序流程均由天津诺禾致源生物信息科技有限公司完成。
1.3 数据分析
1.3.1 测序数据处理
根据Barcode序列和PCR扩增引物序列，截去Barcode和引物序列后使用FLASH（Version1.2.http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/）对每个样本的Reads进行拼接，得到的拼接序列为原始Tags数据；拼接得到的原始Tags数据，经过严格的过滤处理得到高质量的Tags数据。参照Qiime（Version1.9.1.http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html）的Tags质量控制流程，进行Tags截取及长度过滤之后进行去除嵌合体序列的处理，Tags序列通过（https://github.com/torognes/vsearch/）与物种注释数据库进行比对检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据。
1.3.2 菌群多样性分析
通过Uparse软件（Uparse version7.0.1001.http://www.drive5.com/uparse/）对所有样本进行聚类，用Mothur方法与SILVA132（http://www.arb-silva.de/）的SSUrRNA数据库进行物种注释分析（设定阈值为0.8～1），获得在各个分类水平分类学信息。通过Qiime软件（Version 1.9.1）计算Chao1、Shannon、Simpson指数，使用R软件（Version 2.15.3）绘制稀释曲线及Alpha多样性指数组间差异分析。
基于Qiime软件（Version 1.9.1）计算Unifrac，并通过R软件进行Beta多样性指数组间差异分析。然后对菌群组成进行多级物种差异判别分析（LEfSe），默认设置LDA Score的筛选值为4，且利用R软件分析组间差异显著的物种。
2. 结果与分析
2.1 牦牛乳和犏牛乳常规营养成分对比
牦牛乳和犏牛乳的9个常规营养成分检测，并利用SAS 9.4在0.05水平下对其进行显著性单因素方差分析，结果如表1所示。牦牛乳中各项指标的检测结果均高于犏牛乳，且二者蛋白、非脂固形物、总乳固形物及密度的差异显著（P<0.05）。
表 1 牦牛和犏牛乳常规营养成分Table 1. Nutritional component contents of yak and cattle-yak milk检测指标 牦牛乳 犏牛乳 脂肪（%） 5.777 ± 1.111a 5.346 ± 0.982a 蛋白（%） 5.315 ± 0.318a 4.532 ± 0.317b 乳糖（%） 5.485 ± 0.353a 5.425 ± 0.161a 非脂固形物（%） 11.205 ± 0.303a 10.319 ± 0.452b 总乳固形物（%） 17.672 ± 1.313a 16.389 ± 0.968b 冰点（℃） 0.622 ± 0.039a 0.612 ± 0.013a 密度（kg/m3） 1033.519 ± 2.652a 1029.944 ± 4.349b 酸度（°T） 17.863 ± 3.334a 16.829 ± 1.842a 电导（s/m） 0.211 ± 0.002a 0.196 ± 0.001a 注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P<0.05）。 2.2 微生物多样性分析
2.2.1 样品测序结果及多样性指数
经PCR-free文库构建、测序、Reads拼接后平均每样品测得93918条序列，经质控过滤平均得到75922条有效数据，质控有效数据量达63698，质控有效率达68.28%。基于97%一致性对OTUs进行注释，共得到5516个OTUs。如图1所示，稀释曲线逐渐趋于平缓，表明测序结果合理，且间接反映了物种的丰富度，即样本的当前测序深度足够反映该群落样本所包含的微生物多样性。如图2所示，Rank Abundance曲线直观地反映样品中物种的丰富度和均匀度，水平方向的曲线跨度体现了物种丰富度，曲线在横轴上的范围较大，表明物种丰度较高；垂直方向的曲线渐进平缓，表明物种分布均匀。
如表2所示，采用Shannon和Simpson指数对牦牛乳和犏牛乳中微生物的多样性进行评价，采用Observed species和Chao1对二者微生物菌群的丰度进行评价，结果表明犏牛乳中所含物种数较牦牛乳高，二者微生物菌群丰度差异显著，但菌群多样性相似。
表 2 基于T检验的Alpha多样性指数分析Table 2. Alpha diversity index analysis based on T test分组 Observed_species Chao1 Shannon Simpson 牦牛乳 1744 ± 263.151 1937.263 ± 305.764 7.193 ± 0.916 0.953 ± 0.056 犏牛乳 2145 ± 510.734 2456.423 ± 572.069 7.695 ± 1.229 0.965 ± 0.022 P 0.033 0.024 0.217 0.351 2.2.2 微生物群落组成分析
2.2.2.1 物种韦恩图分析
由图3可知，共测得5516个OTUs，共有OTUs 2506个，牦牛乳组（yak）和犏牛乳组（dzo）分别特有1054和1956个OTUs，犏牛乳特有的OUTs相对牦牛乳较高，表明犏牛乳中的微生物群落较牦牛乳丰富。
2.2.2.2 微生物门分类水平的比较
牦牛乳和犏牛乳在门水平上前10种微生物相对丰度比较结果如图4显示，牦牛乳和犏牛乳中变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度分别为29.80%、45.36%；厚壁菌门（Firmicutes）的相对丰度分别为35.99%、25.79%；放线菌门（Actinobacteria）的相对丰度分别为8.41%、7.39%。从菌群门水平排名前十的热图（图5）可知，犏牛乳中芽单胞菌门（Gemmatimonadetes
）、酸杆菌门（Acidobacteria）及变形菌门等较为常见，而牦牛乳则以厚壁菌门、拟杆菌门（Bacteroidetes）及柔膜菌门（Tenericutes）为主。 2.2.2.3 微生物属分类水平的比较
牦牛乳和犏牛乳微生物前10属水平比较如图6所示，结果表明牦牛乳中的优势菌属为未分类的蓝藻细菌属（unidentified-Cyanobacteria）；犏牛乳中优势菌属为慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium），其次是耶尔森菌属（Yersinia）、乳杆菌属（Lactobacillus）及贪铜菌属（Cupriavidus）。两种牛乳中都含有这几种微生物，但所占比例差异较大。耶尔森菌属和贪铜菌属在犏牛乳中所占比例明显高于牦牛乳，而乳杆菌属的含量在犏牛乳中较牦牛乳相比更低。
2.2.2.4 微生物种分类水平的比较
牦牛乳和犏牛乳微生物前10种水平比较表明，埃尔坎尼中慢生根瘤菌种（Bradyrhizobium elkanii）和Kosakonia oryzae为牦牛乳和犏牛乳中的优势菌种，其中埃尔坎尼中慢生根瘤菌种在犏牛乳中的相对丰度较高，达11.53%，比牦牛乳中所占比例高；菌种Kosakonia oryzae在犏牛乳（5.53%）的占比同样比牦牛乳（3.36%）高（图7）。
2.2.2.5 物种主坐标分析
基于unweightedUnifrac距离进行物种主坐标分析（图8），结果显示，第一主成分对样品差异的解释率为25.57%，第二主成分对样品差异的解释率为18.39%。牦牛乳和犏牛乳分别聚集在一起，两组样本距离较近，由此可知，牦牛乳和犏牛乳微生物群落差异轻微。
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图 8 基于unweightedUniFrac距离的PCoA主坐标分析Figure 8. PCoA analysis based on unweightedUniFrac distance2.2.3 组间差异分析
对牦牛、犏牛乳的LEfSe分析，LDA线性判别分析结果见图9A，LDA score>4的物种共有八种，其中莫拉菌科（Moraxellaceae）、假单胞菌目（Pseudomonadales）、莫拉氏菌属（Moraxella）及肉杆菌科（Carnobacteriaceae）对牦牛乳的菌群结构具有显著影响；δ-变形菌纲（Deltaproteobacteria）、unidentified_Gammaproteobacteria、伯克氏菌科（Burkholderiaceae）及α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）则与犏牛乳微生物群落结构相关。
2.3 乳常规和微生物相关性分析
图10为优势物种Spearman相关系数分析热图，揭示了环境因子与物种之间的关系。纵向为环境因子信息（脂肪、蛋白质、乳糖、非脂固形物和总乳固形物），横向为物种信息（微生物），中间热图对应的值为Spearman相关系数r，介于−1和1之间，r<0为负相关，r>0为正相关。由图可知，牦牛乳和犏牛乳中的共性优势菌门中的变形菌门与乳脂肪、蛋白质、乳糖、非脂固形物及总乳固形物均呈负相关；放线菌门与乳糖呈负相关，与其他的指标呈正相关；牦牛乳中主要的厚壁菌门与乳脂肪、蛋白质、乳糖、非脂固形物及总乳固形物均呈正相关；异常球菌-栖热菌门（Deinococcus-Thermus） 与牦牛乳和犏牛乳中具有显著差异的蛋白质呈显著正相关（P<0.05）；犏牛乳中常见的芽单胞菌门与脂肪、乳糖及总乳固形物呈正相关，与蛋白质、非脂固形物呈负相关。
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图 10 Spearman相关性分析热图注：*表示显著，P <0.05；**表示极显著，P <0.01。Figure 10. Spearman correlation analysis heat map3. 讨论
牦牛乳作为藏区牧民营养摄取的主要来源之一，对多种疾病有较好的预防作用，有助于降低代谢综合征发病率[20]。本试验通过对牦牛乳和犏牛乳常规营养成分的测定，得出牦牛乳和犏牛乳的蛋白质、非脂固形物、总乳固形物及密度差异显著（P<0.05）。引起乳营养成分含量差异的原因有很多，如牛群遗传特性、泌乳生理差异及日粮营养结构等[21]。而该试验在同一饲养环境中，且年龄、泌乳期、胎次、健康状况基本相同的前提下进行的，则出现这种差异的主要原因可能取决于品种及个体遗传因素。
随着科学技术的进步，人们已经了解到家畜的原乳有自己独特的内原微生物群落，对人类和家畜后代的健康都有影响[22]。本试验结果显示犏牛乳的细菌丰富度较牦牛乳高，而两种乳的细菌多样性相似。犏牛作为牦牛和黄牛的杂交品种，其杂种优势明显，由韦恩图分析结果可知牦牛乳和犏牛乳二者所共有的微生物物种很多，但犏牛乳中特有的微生物与物种高于牦牛乳，推测犏牛杂种优势及遗传特性可能是其乳中细菌丰富度较高的原因[23-24]。在微生物门分类水平上，与张敏[25]的研究结果相似。此外，本研究结果牦牛乳中拟杆菌门的含量也较多。拟杆菌门的拟杆菌通过抑制脂肪细胞中脂蛋白脂酶活性，从而对脂质代谢产生积极影响，且该菌与家畜肠道免疫有关[26]。当机体脂质代谢异常时则会引起许多常见的疾病，对机体健康造成威胁。因此，牦牛乳可能对家畜脂质代谢及提高食用者及有犊牛的肠道免疫有积极影响，更有利于脂肪在小肠的消化吸收为机体提供所需要的能量，但这需要进一步试验来证明。本试验在属水平上主要的优势属为慢生根瘤菌属、耶尔森菌属及未分类的蓝藻细菌属，与发酵乳制品优势菌属相比完全不同，鲜乳通过不同的加工方式加工后其细菌的多样性及种属结构可能会发生改变。耶尔森菌属中的部分菌种会通过破坏细胞死亡途径，扰乱炎症过程并利用免疫细胞促进疾病，对人类具有致病性[27]。而结果中含有该细菌，可能是因为牛乳在挤奶过程中被外界环境所污染，有研究表明，耶尔森菌属多存在于粪便中，由此推断，有害菌群的产生可能是因为牦牛饲养管理不当，采样时牛乳可能被粪便污染所致[28]。乳杆菌属是一类能够利用碳水化合物产生乳酸的杆状细菌，长期以来被用于制造乳制品，该菌属有25个菌种部分具有产生抗氧化剂并且具有益生菌潜力，通过抗炎反应参与机体的免疫调节[29]。犏牛乳中乳杆菌属的比例更高，可能是更理想的原料奶。
通过 Spearman相关性分析比较乳常规和微生物的关系，牦牛乳和犏牛乳中的变形菌门与乳脂肪、蛋白质、乳糖、非脂固形物及总乳固形物呈负相关，而厚壁菌门与乳常规营养成分呈正相关。有研究报道，厚壁菌门与小鼠肥胖密切相关，促进肠道对单糖的吸收，诱导脂肪形成[30-31]。细菌门水平分类比较结果表明，牦牛乳中的厚壁菌门含量较犏牛乳高，而乳常规营养成分分析结果同样也表明牦牛乳中脂肪和乳糖含量比犏牛乳高。牦牛乳中脂肪和乳糖含量较高的原因可能与此有关。
4. 结论
营养成分分析：牦牛乳和犏牛乳蛋白质、总乳固形物、非脂固形物及密度差异显著（ P <0.05），其他乳常规营养成分差异不显著。微生物多样性分析：牦牛乳和犏牛乳微生物丰度差异明显，且犏牛乳的微生物丰度及多样性较高。通过Spearman相关性分析发现两种乳营养成分含量的差异与其微生物组成之间具有相关性。这为进一步研究青藏高原牦牛乳和犏牛乳的营养调控提供了理论依据。
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图 8 基于unweightedUniFrac距离的PCoA主坐标分析
Figure 8. PCoA analysis based on unweightedUniFrac distance
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图 10 Spearman相关性分析热图
注：*表示显著，P <0.05；**表示极显著，P <0.01。
Figure 10. Spearman correlation analysis heat map
表 1 牦牛和犏牛乳常规营养成分
Table 1 Nutritional component contents of yak and cattle-yak milk
检测指标 牦牛乳 犏牛乳 脂肪（%） 5.777 ± 1.111a 5.346 ± 0.982a 蛋白（%） 5.315 ± 0.318a 4.532 ± 0.317b 乳糖（%） 5.485 ± 0.353a 5.425 ± 0.161a 非脂固形物（%） 11.205 ± 0.303a 10.319 ± 0.452b 总乳固形物（%） 17.672 ± 1.313a 16.389 ± 0.968b 冰点（℃） 0.622 ± 0.039a 0.612 ± 0.013a 密度（kg/m3） 1033.519 ± 2.652a 1029.944 ± 4.349b 酸度（°T） 17.863 ± 3.334a 16.829 ± 1.842a 电导（s/m） 0.211 ± 0.002a 0.196 ± 0.001a 注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P<0.05）。 
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表 2 基于T检验的Alpha多样性指数分析
Table 2 Alpha diversity index analysis based on T test
分组 Observed_species Chao1 Shannon Simpson 牦牛乳 1744 ± 263.151 1937.263 ± 305.764 7.193 ± 0.916 0.953 ± 0.056 犏牛乳 2145 ± 510.734 2456.423 ± 572.069 7.695 ± 1.229 0.965 ± 0.022 P 0.033 0.024 0.217 0.351
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