Separation and Purification of Kudinoside D and Its Nanoparticle Preparation and Characterization
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摘要: 目的：为了提高苦丁皂苷D的水溶性。方法：采用常压柱层析法、半制备高效液相色谱法等手段从苦丁茶冬青中分离纯化皂苷，获得化合物苦丁皂苷D（Kudinoside D）。以聚谷氨酸（γ-PGA）和L-苯丙氨酸乙酯（L-PAE）为原料，分别采用沉淀法、透析法制备苦丁皂苷 D纳米粒，利用透射电镜和动态纳米粒度仪对纳米粒理化性质进行表征，利用透析法考察其体外释药特性。结果：与沉淀法相比，透析法制备的苦丁皂苷 D纳米粒的包封率和载药量分别提高了1.5、4.5倍，包封率达65.46%，载药量达13.24%。苦丁皂苷 D纳米粒呈规则球形，平均粒径为（75±25）nm，Zeta电势为33.7。结论：体外释药实验表明苦丁皂苷 D纳米粒可提高药物的水溶性，具有良好的体外缓释效果。Abstract: Objective: To improve the water solubility of Kudinoside D. Methods: Using atmospheric column chromatography, semi-preparative high performance liquid chromatography and other means to separate and purify saponins from Ilex kudingcha C.J.Tseng, the compound Kudinoside D was obtained. Using polyglutamic acid (γ-PGA) and L-phenylalanine ethyl ester (L-PAE) as raw materials, Kudinoside D nanoparticles were prepared by precipitation method and dialysis method respectively. The physical and chemical properties of nanoparticles were characterized by transmission electron microscopy and dynamic nanoparticle size analyzer, and their in vitro drug release characteristics were investigated by dialysis. Results: Compared with the precipitation method, the encapsulation efficiency and drug loading of Kudinoside D nanoparticles prepared by the dialysis method were increased by 1.5 and 4.5 times, respectively, the encapsulation rate reached 65.46%, and the drug loading reached 13.24%. Kudinoside D nanoparticles had a regular spherical shape with an average particle size of (75±25) nm and a Zeta potential of 33.7. Conclusion: In vitro drug release experiments show that Kudinoside D nanoparticles can significantly improve the water solubility of the drug and have a good sustained release effect in vitro.
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Keywords:
- Kudinoside D /
- γ-PGA-PAE /
- nanoparticles /
- characterization /
- isolation and purification
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苦丁茶冬青（Ilex kudingcha C.J.Tseng）为冬青科冬青属乔木植物，是药、饮兼用之名贵珍品[1-2]，富含五环三萜及皂苷类、黄酮、甾体、多糖等多种化学成分[3-4]，具有降血脂、降血糖、抗肿瘤、抗氧化等多种生物学活性[5-10]。苦丁皂苷D（Kudinoside D）是从苦丁茶冬青中提取的三萜皂苷类化合物[11-12]，研究表明Kudinoside D能抑制胆固醇肠道吸收，显著降低血浆中总胆固醇、总甘油三酯且升高血浆高密度脂蛋白的水平，此外还有降低甘油三酯、抗氧化、肾保护和改善血液流变学等作用，可以用于治疗高血脂及其相关疾病，具有良好的制药用途[13]。
虽然Kudinoside D有良好的保健作用，但Kudinoside D水溶性差，生物利用度低，这是导致其药效作用发挥不佳的重要因素。随着纳米技术的发展，纳米药物载体在提高难溶性药物溶解度方面的作用日益凸现[14-19]。聚谷氨酸（γ-PGA）具有无毒性、生物相容性高等优点[20-21]，L-苯丙氨酸乙酯（L-PAE）可作为疏水基团与γ-PGA形成良好的两亲性纳米载药系统[22-24]。两亲性聚合物γ-PGA-PAE的亲脂端可以包裹脂溶性药物，同时其亲水性可以使被包裹的药物形成良好的水化层，使药物水溶性和稳定性更高[25]。然而目前纳米制剂的研究多为化学药物纳米制剂，对植物提取物纳米制剂的研究较少，与此同时大多数纳米粒的相关研究普遍只从纳米粒的制备方面着手，少有筛选载药纳米粒制备方法的研究报道。
为了提高Kudinoside D的生物利用度，本研究分别采用沉淀法、透析法制备Kudinoside D纳米粒，并对其理化性质进行表征，为开发保健功能效果更好的Kudinoside D新型制剂提供一定的实验基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
苦丁茶冬青 海南省产；聚谷氨酸（γ-PGA） 海宁市紫金港生物科技有限公司；硅胶100~200目 青岛海洋化工有限公司；L-苯丙氨酸乙酯盐酸盐（L-PAE） 上海麦克林生化科技有限公司；碳酰二亚胺盐酸盐（EDC.I） 美国阿拉丁工业公司；二甲基亚砜（DMSO）、氘代二甲基亚砜 北京鼎国昌盛生物技术有限公司；氯化钠、二氯甲烷、盐酸 北京化学试剂公司；乙腈、甲醇 色谱纯，美国Fisher公司；透析袋 北京索莱宝科技有限公司；超纯水 实验室自制；其他试剂均为分析纯。
LC-20A型高效液相色谱仪 日本岛津公司；FW10C高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；HH-6数显恒温水浴锅 常州中捷实验仪器制造有限公司；PHS-3E型pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；Millipor-Q型超纯水机 美国Millipor公司；LKTC-E恒温振荡器 金坛市城东新瑞仪器厂；Hwcb-2恒温磁力搅拌器 温州市医疗电器场；5424R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；FD-1D-50真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；AV600一维及二维核磁共振谱 美国Bruker公司；HT7820透射电镜 日本日立公司；动态纳米粒度仪 英国Malvem Instruments公司。
1.2 实验方法
1.2.1 Kudinoside D的分离纯化及鉴定
参考文献[26]方法，称取7.5 kg干燥的苦丁茶冬青叶粉碎，用8 BV 70%乙醇浸提3次，每次5 d，合并提取液减压浓缩（40 ℃）至无醇味，制得浸膏。分别用3 L×4 L的石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇依次萃取：将流体状浸膏转入分液漏斗中，先加入4 L萃取剂充分振摇，静置分层，收集有机溶剂部分，共萃取3次，合并萃取液；再在流体状浸膏中加入下一萃取剂用同样方法重复萃取3次。将各萃取部位减压浓缩、低温蒸干（40 ℃）后，固体粉碎过100目筛。取正丁醇萃取部位粉末100 g，经正向硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇（4:1）50倍体积洗脱，收集洗脱部分，再经ODS填料甲醇-水（8:1）50倍体积洗脱，半制备型高效液相纯化，得到化合物I-9 162 mg。
色谱条件：选用YMC-Pack C18柱，流动相乙腈（A）-水（B）二元梯度洗脱，0～15 min 30% A，15～45 min 30%～50% A，分析时间45 min，流速2.0 mL/min，柱温35 ℃，检测波长254 nm，进样量40 μL。
鉴定：称取5 mg化合物I-9用0.5 mL氘代吡啶溶解，转移至核磁管中，进行核磁检测（1H-NMR、13C-NMR）。1H-NMR测定条件：测定温度298 K，频率600 MHz，谱宽33333 Hz；13C-NMR测定条件：测定温度298 K，频率150 MHz，谱宽33333 Hz。
1.2.2 聚谷氨酸与L-苯丙氨酸乙酯共聚物（γ-PGA-PAE）的合成
参考文献[27]方法，称取1.01 g γ-PGA，加入超纯水50 mL,在恒温振荡器中振摇5～6 h（37 ℃，200 r/min）充分溶解。调节γ-PGA溶液的pH至3.0（1 mol/L HCL溶液），置于98 ℃恒温水浴中，降解9 min，立即冰浴冷却，再将溶液的pH调至7.0（1 mol/L NaOH溶液），结束降解反应，得到小分子γ-PGA溶液。
称取EDC.I 2.61 g加入上述小分子γ-PGA溶液中，于恒温振荡器中振摇15 min（37 ℃，200 r/min），再加入L-PAE 1.06 g，于恒温振荡机中反应24 h（37 ℃，200 r/min）。反应产生白色沉淀，用超纯水洗涤（离心14000 r/min，10 min），弃上清，重复3次，将沉淀物质真空冷冻干燥48 h，得到产物γ-PGA-PAE 1.24 g。
1.2.3 γ-PGA-PAE的纯化与鉴定
将1.2.2中得到的γ-PGA-PAE材料溶解于5 mL的DMSO溶液中，再将该溶液用滴管滴加于5 mL超纯水中，滴加后得到乳白色半透明溶液，离心（14000 r/min，10 min）后弃去上清，清洗过程重复三次。将沉淀真空冷冻干燥24 h以上，得到已纯化的γ-PGA-PAE材料。取500～600 μL氘代DMSO加入到纯化后的γ-PGA-PAE材料（6～8 mg）中，于恒温震摇器中振荡24 h以充分溶解（37 ℃，120 r/min）。将样品溶液转移至核磁管中，进行核磁检测（1H-NMR）。
1.2.4 Kudinoside D纳米粒的制备
称取5 mg Kudinoside D和20 mg γ-PGA-PAE，溶解于2 mL DMSO中，将混合溶液用滴管缓慢滴加于2 mL超纯水中，磁力搅拌3~4 h（120 r/min），制成纳米粒溶液，同样方法另制备一份纳米粒溶液。将一份纳米粒溶液在高速冷冻离心机中离心10 min（14000 r/min），弃上清，收集底部沉淀；另一份纳米粒溶液，转移至透析袋（截留相对分子质量1500）中并用循环水透析24 h，收集底部沉淀。将收集的两份物质真空冷冻干燥24 h后分别得Kudinoside D纳米粒15.08 mg、24.62 mg。比较两种方法制得纳米粒的包封率与载药量，择优进行表征及体外释药特性的考察。
1.2.5 包封率、载药量测定
HPLC色谱条件：Angilent Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相乙腈-水（4:6），流速1.0 mL/min，柱温35 ℃，检测波长为254 nm。此色谱条件下对Kudinoside D对照品进行线性关系考察。精密称取Kudinoside D 10 mg于100 mL容量瓶中，加入甲醇定容得浓度为100 μg/mL的药物溶液。取适量溶液配制成1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0、15.0 μg/mL的溶液，进样20 μL，以峰面积（Y）与质量浓度（X）进行线性回归。
称取Kudinoside D纳米粒5 mg加入1 mL丙酮，超声10 min溶解，用旋转蒸发仪（40 ℃）去除有机相，再加入2 mL甲醇超声5 min，经0.45 μm的微孔滤膜过滤后得到供试品溶液。HPLC法检测包封率和载药量，HPLC色谱条件同上。
包封率EE（%）=（W1/W2）×100
载药量DL（%）=（W1/W3）×100
式中：W1为载药纳米粒中药物的质量，mg；W2为总投药量，mg；W3为载药纳米粒总质量，mg。
1.2.6 Kudinoside D纳米粒的表征
取适量Kudinoside D纳米粒用超纯水重悬，通过动态纳米粒度仪检测纳米粒尺寸、粒径分布及Zeta电位。将Kudinoside D纳米粒重悬样品滴加到铜网上，烘干，用1%的钼酸铵溶液染色后，通过透射电镜检测Kudinoside D纳米粒的形态和尺寸。
1.2.7 Kudinoside D纳米粒的体外释药特性考察
称取Kudinoside D纳米粒5 mg，加入适量0.1 mol/L的PBS（pH7.4）超声分散，转移至透析袋中（截留相对分子质量1500），将透析袋扎紧后置于含有50 mL PBS的烧杯中，于恒温振荡器中振荡48 h（37 ℃，100 r/min），定时取样2 mL，同时补加同等体积0.1 mol/L的PBS（pH7.4）。用HPLC外标法检测Kudinoside D的含量，色谱条件同1.2.5，并计算释药量。
释药量DR（%）=（W4/W1）×100
式中：W4为透析后释放的药物质量，mg；W1为载药纳米粒中药物的质量，mg。
1.3 数据处理
本文所用数据为2次平行实验结果均值；绘图软件采用ChemDraw。
2. 结果与分析
2.1 Kudinoside D的结构鉴定
1.2.1中制得的化合物为白色粉末I-9。HPLC检测结果显示化合物的色谱峰保留时间与Kudinoside D一致，为6.29 min；1H-NMR（600 MHz，Pyridine-d5）谱鉴定结果显示，δ0.85、0.90、1.07、1.24、1.41、1.55、1.71（各3H，s）为五环三萜母核上7个甲基质子信号，δ3.32（dd，J=11.7 4.4 Hz）为C-3上连氧次甲基质子信号，5.79（dd，J=10.6，1.9 Hz）和7.53（dd，J=10.5，3.1 Hz）为一对顺式双取代的烯质子信号，δ4.90（d，J=5.7 Hz，1H）、5.14（d，J=7.8 Hz，1H）、6.20（s，1H）分别为三个糖（Ara、Rha、Glc）端基碳质子信号；13C-NMR（600 MHz，Pyridine-d5）谱图中共显示47个碳信号，其中δc175.34为C-28羰基信号，δc127.31、128.55和140.85、135.12分别为C-11和C-12位及C-13与C-18形成的共轭双键碳信号，δc104.99（3-Ara-1）、δc104.92（Glc-1）、δc102.11（Rha-1）分别为三个糖基的端基碳信号。该化合物的核磁数据与文献[28]中Kudinoside D的报道吻合，故确认化合物为 Kudinoside D。化合物液相色谱谱图如图1，核磁结果如图2、图3，分子结构式如图4。
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图 1 化合物I-9与Kudinoside D液相色谱图Figure 1. Liquid chromatogram of compound I-9 and Kudinoside D2.2 γ-PGA-PAE的鉴定
为改善高分子材料γ-PGA水溶液黏度过高不利于L-PAE进行修饰反应的问题，本文采取了高温酸解法，将分子量较大的γ-PGA降解，再加入EDC.I进行缩合反应，从而使γ-PGA侧链的羧基和L-PAE上的氨基都脱去一分子的H2O，形成肽键后在γ-PGA的侧链上成功连接L-PAE，形成两亲性聚合物γ-PGA-PAE[27,29-30]。1H-NMR结果显示（图5），图谱中标注的a、b、c、d处符合γ-PGA的特征峰（δ值分别为7.89、4.27、1.85、2.13 ppm），图上标注的e、f、g、h、i和j处符合L-PAE的特征峰（δ值分别为8.34、4.43、3.99、1.07、3.00、7.18 ppm），与文献[22]一致,说明L-PAE与γ-PGA已成功连接组装为两亲性的γ-PGA-PAE材料。
2.3 Kudinoside D的纳米粒包封率和载药量
经HPLC检测，回归方程为Y=3963.8X−7.875（R2=0.9997），在1.0~15 μg/mL范围内线性关系良好，可用于药物含量的测定和体外溶解度实验分析。沉淀法制备的纳米粒包封率为44.14%，载药量为2.99%；透析法制备的纳米粒包封率为65.46%，载药量为13.24%。故选用透析法制备的纳米粒进行表征和体外缓释效果的考察。
2.4 Kudinoside D纳米粒的形态表征
本研究制备的Kudinoside D纳米粒冻干粉末呈白色，溶液为乳白色透明液体。透射电镜结果显示（图6），Kudinoside D纳米粒呈现规整的圆球形，大小较均一，分布均匀，无明显的团聚现象，根据粒径分布图可判断（图7），Kudinoside D纳米粒平均半径为（75±25）nm，分散系数为0.18，Zeta电势为33.7，表明所得纳米粒大小理想，分布较集中，带有较强正电荷，稳定性较好。
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图 7 Kudinoside D纳米粒的粒径分布图Figure 7. Particle size distribution of Kudinoside D nanoparticles2.5 Kudinoside D纳米粒的体外缓释效果考察
由图8可知，与Kudinoside D纳米粒相比，游离Kudinoside D在3 h时就已释放了50%，在10 h时已经完全释放，而Kudinoside D纳米粒较游离Kudinoside D无明显突释现象，药物在10 h时才释放到达50%，之后释放趋于平缓。体外缓释实验表明Kudinoside D的纳米粒具有缓释特点，这说明Kudinoside D纳米粒能增加血药浓度作用的时间。
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图 8 Kudinoside D纳米粒的缓释曲线Figure 8. Sustained release curve of Kudinoside D nanoparticles3. 结论
本研究以γ-PGA-PAE为载体，采用沉淀法和透析法制备Kudinoside D纳米粒，结果显示透析法制备纳米粒的包封率为65.46%，载药量为13.24%；沉淀法制备纳米粒的包封率为44.14%，为载药量2.99%，说明所得纳米粒包封率较高，载体对药物有很好的相容性。高包裹率的纳米粒能显著提高Kudinoside D的稳定性，故对包封率和载药量更高的透析法制备的Kudinoside D纳米粒进行表征和体外缓释效果考察。结果显示所得Kudinoside D纳米粒粒径均一，平均粒径为（75±25）nm，分散度良好，同时Kudinoside D纳米粒与单纯Kudinoside D药物相比具备了更好的缓释效果。Kudinoside D纳米粒的缓释特性能使血药浓度维持平稳，可避免药物的快速降解，减少给药次数，增加药物作用时间。此外，Kudinoside D纳米粒具有良好的纳米尺寸，对其进行修饰可制备脑内药物递送系统。本研究对Kudinoside D纳米粒进行了体外表征，其体外生物活性还需要进一步验证。虽然纳米药物制剂发展前景广阔，但目前大多处于实验室研究的阶段，尤其是靶向纳米药物制剂，体内生物实验经验积累更少。制备纳米药物制剂过程中使用的辅料的毒性问题及载药纳米粒进入机体后是否会沉积等问题仍需研究。再者，目前纳米药物制剂的制备主要是在实验室制备，同时对所生产的纳米药物制剂尚未有完善的质量标准评价体系，对其进行质量的把控。总而言之，纳米药物制剂在药物制剂乃至临床医药领域都有很高的研究价值，值得深入探究。
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图 1 化合物I-9与Kudinoside D液相色谱图
Figure 1. Liquid chromatogram of compound I-9 and Kudinoside D
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图 7 Kudinoside D纳米粒的粒径分布图
Figure 7. Particle size distribution of Kudinoside D nanoparticles
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[1] 张灿坤. 苦丁茶的原植物及商品调查[J]. 中药材,1994,17(3):14−15. [Zhang Cankun. Original plants and market drugs investigation of Kudingcha[J]. Journal of Chinese Medicinal Materials,1994,17(3):14−15. doi: 10.3321/j.issn:1001-4454.1994.03.016 [2] Gan R Y, Zhang D, Wang M, et a1. Health benefits of bioactive compounds from the genus ilex, a source of traditional caffeinated beverages[J]. Nutrients,2018,10(11):1682. doi: 10.3390/nu10111682
[3] 黄燕, 郑金燕, 杨刚劲, 等. 苦丁茶冬青根的化学成分研究[J]. 中草药,2015,46(16):2371−2376. [Huang Yan, Zheng Jinyan, Yang Gangjin, et a1. Chemical constituents in roots of Ilex Kudingcha[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs,2015,46(16):2371−2376. [4] Svenja Wüpper, Kai Lüersen, Gerald Rimbach. Chemical composition, bioactivity and safety aspects of Kuding tea—from beverage to herbal extract[J]. Nutrients. 2020, 12(9): 2796.
[5] Song C, Yu Q, Li X, et a1. The hypolipidemic effect of total saponins from Kuding tea in high-fat diet-induced hyperlipidemic mice and its composition characterized by UPLC-QTOF-MS/MS[J]. Journal of Food Science,2016,81(5):1313−1319. doi: 10.1111/1750-3841.13299
[6] 李小华. 苦丁茶皂苷降血脂作用的成分研究[D]. 武汉: 华中科技大学, 2016. Li Xiaohua. A study on composition and hypolipidemic effect of total saponins from Kuding tea[D]. Wuhan: Huazhong University of Science and Technology, 2016.
[7] 耿江枫. 苦丁冬青胰脂肪酶抑制活性成分研究[D]. 贵阳: 贵州师范大学, 2016. Geng Jiangfeng. Pancreatic lipases inhibition active constituents from Ilex Kudingcha C. J. Tseng[D]. Guiyang: Guiyang Normal University, 2016.
[8] Zhang T T, Hu T, Jiang J G, et a1. Antioxidant and anti-inflammatory effects of polyphenols extracted fromIlex latifolia Thunb[J]. RSC Advances,2018,8(13):7134−7141. doi: 10.1039/C7RA13569F
[9] Yi H, Zhou J, Shang X Y, et a1. Multi-component analysis of Ilex Kudingcha C. J. Tseng by a single marker quantification method and chemometric discrimination of HPLC fingerprints[J]. Molecules,2018,23(4):854. doi: 10.3390/molecules23040854
[10] Zhang H L, Zou X Q, Huang Q Y, et a1. Effects of Kudingcha nanoparticles in hyperlipidaemic rats induced by a high fat diet[J]. Cellular Physiology and Biochemistry,2018,45:2257−2267. doi: 10.1159/000488171
[11] Tang L, Jiang Y, Tian X M, et a1. Triterpene saponins from the leaves of Ilex Kudingcha[J]. Journal of Asian Nmuml Products Research,2009,11(6):554−561. doi: 10.1080/10286020902937491
[12] Tang L, Jiang Y, Chang H T, et a1. Triterpene saponins from the leaves of Ilex Kudingcha[J]. Journal of Natural Products,2005,68(8):1169−1 174. doi: 10.1021/np050043z
[13] 北京大学. 苦丁茶皂苷D的制药用途: 中国, ZL2012101353603[P]. 2013-11-06. Beijing. Pharmaceutical use of Kudingcha saponin D: China, ZL2012101353603[P]. 2013-11-06.
[14] 盛竹君, 徐维平, 徐婷娟, 等. 纳米技术在难容性药物制剂研究中的应用[J]. 广州化工,2016,44(1):13−15. [Sheng Zhujun, Xu Weiping, XU Tingjuan, et a1. Application of nanotechnology in pharmaceutical research for poorly soluble drugs[J]. Guangzhou Chemical Industry,2016,44(1):13−15. doi: 10.3969/j.issn.1001-9677.2016.01.007 [15] 王婷, 顾永卫, 刘继勇, 等. 脂质体纳米载体在改善难溶性中药成分口服吸收中的作用[J]. 药学服务与研究,2020,20(2):140−144. [Wang Ting, Gu Yongwei, Liu Jiyong, et a1. Application of lipid nanocarriers in improving oral absorption of poorly soluble traditional Chinese medicine ingredients[J]. Pharmaceutical Care and Research,2020,20(2):140−144. doi: 10.5428/pcar20200214 [16] 岳鹏飞, 刘阳, 谢锦, 等. 药物纳米晶体制备技术30年发展回顾与展望[J]. 药学学报,2018,53(4):529−537. [Yue Pengfei, Liu Yang, Xie Jin, et a1. Review and prospect on preparation technology of drug nanocrystals in the past thirty years[J]. Acta Pharmaceutica Sinica,2018,53(4):529−537. [17] 金红妍, 李云飞, 高钟镐. 纳米粒载体研发及其对生物效应影响的研究进展[J]. 中国药学杂志,2017,52(10):814−818. [Jin Hongyan, Li Yunfei, Gao Zhonggao. Research progress of nanoparticle carriers and their biological effects[J]. Chinese Pharmaceutical Journal,2017,52(10):814−818. [18] 潘佐, 杨晓峰, 刘红耀. 纳米粒子的生物学性能及光学应用前景[J]. 中国现代医药杂志,2015(11):98−102. [Pan Zuo, Yang Xiaofeng, Liu Hongyao. The biological properties and optical application prospects of nanoparticles[J]. Modern Medicine Journal of China,2015(11):98−102. doi: 10.3969/j.issn.1672-9463.2015.11.034 [19] 陈云艳, 瞿鼎, 郭梦斐, 等. 抗肿瘤中药纳米给药系统的研究进展[J]. 世界科学技术-中医药现代化,2018,20(3):431−438. [Chen Yunyan, Qu Dingguo, Mengfei, et a1. Review on antitumor nano-sized drug delivery system based on traditional chinese medicine[J]. World Science and Technology-Modernization of Traditional Chinese Medicine,2018,20(3):431−438. [20] Shen J Y, Zhao Z M,Wei S, et al. Ginsenoside Rg1 nanoparticle penetrating the blood–brain barrier to improve the cerebral function of diabetic rats complicated with cerebral infarction[J]. Int J Nanomedicine. 2017, 12: 6477-6486.
[21] 贾玉萍, 李秀娥, 邱文旭, 等. γ-聚谷氨酸的研究及应用进展[J]. 鲁东大学学报(自然科学版),2019,35(2):122−128. [Jia Yuping, Li Xiue, Qiu Wenxu, et a1. Research and application of γ-polyglutamic acid[J]. Ludong University Journal(Natural Science Edition),2019,35(2):122−128. [22] Zhang L, Wang T, LI Q, et al. Fabrication of novel vesicles of triptolide for antirheumatoid activity with reduced toxicity in vitro anin vivo[J]. Int J Nanomedicine,2016,11:2663−2673. doi: 10.2217/nnm-2016-0156
[23] Zhang L, Geng X, Zhou J, et al. Fabrication of poly(γ-glutamic acid) -based biopolymer as the targeted drug delivery system with enhanced cytotoxicity to APN/CD13 over-expressed cells[J]. Drug Target,2015,23(5):453−461. doi: 10.3109/1061186X.2014.1003139
[24] Geng X, Ye H, Feng Z, et al. Synthesis and characterization of cisplatin-loaded, EGFR-targeted biopolymer and in vitro evaluation for targeted delivery[J]. J Biomed Mater Res A,2012,100(10):2839−2848.
[25] 沈俊逸, 赵智明, 刘春丽, 等. 人参皂苷Rg1纳米颗粒的构建、和体外功能研究[J]. 东南国防医药, 2019, 11(1): 1-6. Construction and characterization of ginsenoside Rg1 nanoparticles and its in vitro activity[J]. Military Medical Journal of Southeast China, 2019, 11(1): 1-6.
[26] 倪帅帅. 苦丁茶冬青化学成分及其与蛋白质相互作用机理研究[D]. 长春: 吉林农业大学, 2017. Ni Shuaishuai. Studies on the chemical constituents of Ilex Kudingcha c. j. Tseng and its interaction with proteins[D]. Changchun: Jilin Agricultural University, 2017.
[27] 潘盈盈. 长效降血糖GLP1衍生物纳米颗粒的制备及生物学活性研究[D]. 上海: 华东师范大学, 2015. Pan Yingying. Development and bioactivity study of long-acting GLP-1 derivative nanoparticles[D]. Shanghai: East China Normal University, 2015.
[28] Ou yang M A, Yang C R, Chen Z L, et a1. Triterpenes and triterpenoid glycosides from the leaves of Ilex Kudincha[J]. Phytochemistry,1996,41(3):871−877. doi: 10.1016/0031-9422(95)00639-7
[29] Ashiuchi M, Shimanouchi K, Horiuchi T, et al. Genetically engineered poly-gamma-glutamate producer from Bacillus subtilis ISW1214[J]. Biosci Biotechnol Biochem,2006,70(7):1794−1797. doi: 10.1271/bbb.60082
[30] Osera C, Amati G, Calvo C, et al. SwrAA activates poly-glutamate synthesis in addition to swarming in Bacillus subtilis[J]. Microbiology,2009,155(7):2282−2287. doi: 10.1099/mic.0.026435-0
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