Screening of Alkaline Tolerant Xylanase Strains in Rhizomyidae Intestines and Study on Enzymatic Properties
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摘要: 为获得良好耐酸碱性的木聚糖酶，以解决木聚糖酶在实际工业中的应用问题。本研究以木聚糖为唯一碳源，从宜宾竹鼠肠道及粪便中，采用刚果红褪色法初筛和DNS法测定木聚糖酶活进行复筛，筛选了1株具有耐碱性木聚糖酶活性的菌株JZF，16S rDNA序列分析，鉴定为蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides），对蕈状芽孢杆菌JZF的生长曲线、产酶曲线以及产耐碱性木聚糖酶的酶学性质进行初步的探索。结果显示，该菌株于37 ℃，180 r/min培养48 h酶活达到15.17 U/mL；培养28 h后菌体量达到最大值，72 h后木聚糖酶活力达到最大值为29.65 U/mL，所产木聚糖酶最适合反应温度为50 ℃，最适pH9.0；40~60 ℃，pH8.0~9.0条件下相对酶活能保持在60%以上，金属离子Mn2+与Ca2+对该菌株的木聚糖酶有明显的促进作用，本研究所得菌株所产的木聚糖酶在碱性条件下具备良好的活性，为后续耐碱性木聚糖酶的实际应用研究提供了菌种来源与数据基础。Abstract: In order to obtain xylanase with good acid and alkali resistance, to solve the application problem of xylanase in the actual industry. In this study, xylan was used as the sole carbon source. From the intestines and feces of Yibin bamboo rats, the Congo red fading method was used to determine the xylanase activity for re-screening, and one strain with alkaline xylan was screened. Carbohydrase activity strain JZF, 16S rDNA sequence analysis, identified as Bacillus mycoides, the growth curve of Bacillus mycoides JZF, the enzyme production curve and the enzymatic properties of alkaline xylanase explore. The results showed that the enzyme activity of this strain reached 15.17 U/mL after cultured at 37 ℃ and 180 r/min for 48 h; the amount of bacteria reached the maximum after 28 h, the xylanase activity reached the maximum after 72 h, and the most suitable reaction temperature for the produced xylanase was 50 ℃, and the optimum pH was 9.0; the relative enzyme activity could be maintained above 60% under the conditions of 40~60 ℃ and pH8.0~9.0. The metal ions Mn2+ and Ca2+ had obvious effects on the xylanase of this strain. The xylanase produced by the strain obtained in this study has good activity under alkaline conditions, which provides a source and data basis for the subsequent practical application of alkaline xylanase.
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Keywords:
- Bacillus mycoides /
- 16SrDNA /
- alkaline xylanase /
- enzymatic properties
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木聚糖是植物半纤维素的主要成分，是广泛存在于自然界的可再生资源[1-2]。广义的木聚糖酶（Xylanse，EC3.2.1.8）是指可将木聚糖催化水解成低聚木糖的酶的总称，如内切β-1，4-木聚糖酶、外切β-1，4-木聚糖酶、β-木糖苷酶等等，通常所说的木聚糖酶是指内切β-1，4-木聚糖酶（Endo-β-1，4-xylanase），主要功能是随机切断主链中的木聚糖苷键，生成分子量大小不同的木寡糖[3]。木聚糖酶的来源分布广泛，许多微生物如细菌、真菌（霉菌和酵母）、放线菌都能产生木聚糖酶[4]。木聚糖酶具有良好的工业应用价值，如造纸过程中可用于纸浆漂白、改善纤维性质、废纸脱墨；在啤酒酿造过程添加木聚糖酶有利于降低麦汁黏度、提高麦汁的得率以及提高麦汁的过滤速度以及在葡萄酒酿造中能改善葡萄酒质量和稳定性；在烘焙食品行业其能够降低面包的老化率，使面包更加柔软；在饲料工业中添加适当木聚糖酶能够改善饲料性质从而提高饲料利用率[5-9]。
真菌所产木聚糖酶活性普遍高于细菌，但细菌的产酶周期短，酶的稳定性相对较强，不同来源的木聚糖酶最适pH都有所不同，酸性木聚糖酶大多数来源于真菌，如吴仁智等[10]从广西农田中筛选具有酸性木聚糖酶活性的日本曲霉Aspergillus japonicus XYW5，其在pH4.5条件下，木聚糖酶活可达26.26 U/mL。而大部分细菌所产的木聚糖酶接近于中性或偏碱性[11-12]。如郑虹等[13]所筛选的肠杆菌RX-9，其木聚糖酶在pH7.5～9.5具有良好活性。制浆造纸时常需要在高碱性环境进行，过程中常使用氯与次氯酸等进行漂白，会向环境中排放出大量的氯气造成环境的污染，而采用能够耐碱性的木聚糖酶代替则规避了氯气所带来的危害，现如今关于细菌产酶木聚糖酶的报道很少，木聚糖酶酸性和中性的居多，大大制约了木聚糖酶在高碱性环境下的应用[14-18]。竹鼠属于草食性动物，日常主要以纤维素与半纤维素含量丰富的竹子、草根、草秆、甘蔗、玉米等为主要食物，消化粗纤维的能力突出，推测在竹鼠肠道及粪便的碱性条件中，可能存在能够产耐碱性木聚糖酶的特色菌株。因此从竹鼠肠道中筛选出耐碱且酶活性高的木聚糖酶具有重要意义。本文对从竹鼠肠道及粪便中通过刚果红褪色法和DNS法测定木聚糖酶活力，筛选得到的产木聚糖酶菌株进行分子鉴定，观察其生长与发酵产酶过程获得最佳产酶时期，并对该菌株的粗酶液酶学性质进行初探。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
竹鼠样品 于2020年1月采自四川省宜宾市南溪当地农家饲养的银星竹鼠的肠道与粪便样品；刚果红、3，5-二硝基水杨酸、NaCl、蛋白胨、酵母浸粉、MgSO4·7H2O、（NH4）2SO4、琼脂粉 成都市科龙化学品有限公司；木聚糖（山毛榉）、D-木糖 上海源叶生物科技有限公司。
UV-1800型紫外分光光度计 上海翱艺仪器有限公司；立式自动压力蒸汽灭菌器 厦门致微仪器有限公司；生化培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；振荡培养箱 上海知楚仪器有限公司；超净工作台 常州普天仪器制造有限公司；Eppendorf离心机 艾本德生命科学公司。
1.2 实验方法
1.2.1 培养基配制
LB培养基：蛋白胨10 g、酵母浸粉 5 g、NaCl 5 g、蒸馏水 1000 mL、pH7.0。
LB固体培养基：蛋白胨 10 g、酵母浸粉 5 g、NaCl 5 g、琼脂 20 g、蒸馏水 1000 mL、pH7.0。
初筛培养基：蛋白胨5 g、（NH4）2SO4 2 g、MgSO4·7H2O 0.25 g，KH2PO4 0.5 g、木聚糖 10 g，琼脂 20 g、蒸馏水 1000 mL。
试管液体产酶培养基：木聚糖 0.1 g、KH2PO4 0.01 g、MgSO4·7H2O 0.005 g、（NH4）2SO4 0.02 g、蛋白胨 0.025 g、蒸馏水 10 mL、pH自然。
复筛产酶培养基：木聚糖 10 g、KH2PO4 1.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、（NH4）2SO4 2.0 g、蛋白胨 2.5 g、蒸馏水 1000 mL、pH自然。
1.2.2 产木聚糖酶菌株的筛选
取1 g竹鼠肠道内容物于50 mL无菌生理盐水中，置于180 r/min、37 ℃摇床振荡60 min。取2%体积摇匀的液体于LB培养基中过夜培养，取1 mL菌液加入9 mL无菌生理盐水摇匀，梯度稀释至10−7，分别吸取10−4、10−5、10−6、10−7等四个梯度的菌液0.2 mL涂布于初筛培养基上，37 ℃恒温培养24 h。在生长出的菌落中，挑取形态、颜色、大小不同的菌落于LB培养基平板划线，纯化3次后于甘油−80 ℃，斜面4 ℃保藏。
初筛采用刚果红褪色法。菌株在平板上划线纯化后，选择纯化后的菌株接种于种子培养基中，37 ℃培养24 h后，接种于试管液体产酶培养基中，加入1 mL的1 mg/mL刚果红溶液, 37 ℃、180 r/min培养3 d，每天观察试管的颜色变化。
复筛采用酶活测定法，取1 mL初筛优化后的菌株接种于复筛产酶培养基中，37 ℃、180 r/min培养48 h后，取10 mL菌悬液于离心管中，4 ℃、8000 r/min离心10 min得到粗酶液，取1 mL粗酶液测定木聚糖酶活性。
1.2.3 木聚糖酶活力测定
标准曲线绘制：取试管6支，1%木糖标准溶液稀释10倍（1 mg/mL），用移液枪移取0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，再加蒸馏水2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0 mL，再移取加DNS试剂1.5 mL混匀后在沸水浴中煮沸10 min，取出立即用冷水冷却，再加蒸馏水至25 mL摇匀，测定OD540 nm下吸光度值。以木糖浓度为横坐标(x)，吸光度为纵坐标（y），绘制木糖标准曲线。
木聚糖酶活力测定：取1 mL的1%木聚糖溶液，1.5 mL的0.1 mol/L、pH4.8的柠檬酸缓冲溶液于试管中，50 ℃预热5 min，加入1 mL粗酶液于50 ℃下反应10 min，加入2 mL DNS试剂混匀，沸水浴中反应10 min灭酶，取出冷却后加入蒸馏水定容至25 mL，在波长540 nm下检测吸光度值，以空白对照调零[19-20]。
木聚糖酶酶活定义：1 mL酶液在50 ℃、pH5.0的条件下，每分钟酶解木聚糖产生1 μg木糖所需要的酶量定义为1个酶活单位（U）。
1.2.4 菌株的分子生物学鉴定
1.2.4.1 形态鉴定
将菌株于LB固体培养基上划线后，放置于37 ℃恒温箱中培养24 h，肉眼观察菌落的形状、大小、颜色等进行观察记录。挑取单菌落制片后进行革兰氏染色，于光学显微镜下观察菌株形态特征。
1.2.4.2 DNA提取及扩增
用细菌基因组快速抽提试剂盒提取基因组。以细菌基因组DNA为模版，以16S rDNA通用引物进行PCR扩增，引物序列为：27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’，将所得产物送至擎科生物技术有限公司进行DNA序列测定，测序结果用美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）进行BLAST序列分析比较，并用MEGA7.1构建系统发育树。
PCR反应体系：2 μL模版DNA，1 μL 27F引物，1 μL 1492R引物，10 μL Mg2+ Buffer，8 μL dNTP，0.5 μL Taq酶，28.5 μL ddH2O。扩增体系为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30个循环后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
1.2.5 生长曲线测定
将菌株接种于复筛产酶培养基中，37 ℃，180 r/min恒温摇床培养，每隔2 h取样一次，适当稀释后，以未培养LB培养基为空白对照，测定600 nm波长下菌体浓度，绘制菌株生长曲线。
1.2.6 产酶曲线测定
将菌株接种于复筛产酶培养基中，37 ℃，180 r/min恒温摇床培养，每隔12 h取样一次，于540 nm波长下测定木聚糖酶活力，绘制菌株产酶曲线。
1.2.7 木聚糖酶酶学性质研究
1.2.7.1 最适pH和pH稳定性
参照1.2.3中木聚糖酶活测定方法，取1 mL粗酶液与在不同pH的缓冲溶液（柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液pH3.0~8.0；Tris-HC1缓冲液pH8.0~9.0；甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液pH11.0~12.0)与1mL 1%的木聚糖反应，比较得到最佳的pH（以最佳pH条件下的酶活力为100%）；采用上述缓冲溶液与粗酶液按1:1体积混合，50 ℃下保温60 min后立即用冰水冷却，研究酶的pH稳定性（以未处理的酶活力为100%)。
1.2.7.2 最适温度和温度稳定性
将粗酶液在不同温度(20、30、40、50、60、65、70、80、90 ℃)下反应，确定最佳反应温度(以最佳温度条件下的酶活力为100%)。粗酶液在（40、50、55、60、65、70、80 ℃）保温60 min后测定酶活性，研究酶的温度稳定性（以未处理的酶活力为100%）[21-22]。
1.2.7.3 金属离子对酶活力影响
分别配制1.0 mmol/L的金属离子溶液，于1mL粗酶液加入0.5 mL的Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+，对照加水,于常温下静置1h后测定木聚糖酶活力。
1.3 数据分析
采用SPSS进行数据方差分析，图示采用Origin进行作图，实验结果均重复3次。
2. 结果与分析
2.1 产木聚糖酶菌株的筛选
将选择纯化后的菌株接种于种子培养基中，37 ℃培养24 h后，以2%接种量接种于试管液体产酶培养基中，加入1 mL的1 mg/mL刚果红溶液，37 ℃、180 r/min培养3 d，定性分析菌株对于木聚糖分解能力如图1所示，可观察到试管的颜色变化，由于木聚糖随着培养时间增加被分解，试管的颜色从起初的深红色，12 h后转变为浅红，3 d后可观察已有试管成白色的现象。
将从初筛培养基生长得到的菌株分离纯化3次后，挑选10株生长良好具有潜力的菌株接入发酵培养基中37 ℃，180 r/min恒温摇床培养48 h，采用1.2.3方法进行标准曲线绘制与酶活测定。根据图2标准曲线计算木聚糖酶活性如表1。通过木聚糖酶活的测定可得10株菌株都具备木聚糖酶的活性，如表1中JZF菌株木聚糖酶活性相对较高，为15.17 U/mL。
表 1 木聚糖酶酶活测定Table 1. Xylanase activity assay菌株编号 木聚糖酶活（U/mL） JZ3 14.77±0.5592 JZ6 12.18±0.3304 JZ8 12.54±0.1249 JZ11 13.13±0.2481 JZA 14.79±0.3758 JZC 11.77±0.07580 JZB 13.37±0.2274 JZE 11.75±0.1033 JZF 15.17±0.3658 JZG 12.56±0.2006 将该菌株于LB培养基上培养24 h，菌落呈圆形，乳白色，边缘不平整，革兰氏染色呈阳性，菌落形态为长杆状，链状排列，结果如图3、图4所示。
2.2 菌株分子生物学鉴定
以JZF菌株的基因组为模板，PCR扩增出16S rDNA序列后送擎科生物技术有限公司，大小约为1700 bp，电泳检测结果如图5、图6所示。图5表明基因组DNA提取成功，由图6可知，扩增片段分子量在1000~2000 bp范围内，条带清晰明亮无非特异性扩增，表示16S rDNA扩增成功。
将JZF的16S rDNA测序的DNA序列利用NCBI数据库进行BLAST比对，进行相似性分析，结果显示JZF的16S rDNA序列与NCBI基因库中芽孢杆菌属（Bacillus）的16S rDNA同源性最为接近，且一致性均在97%以上，从其中挑选10株的16S rDNA基因序列，通过比邻法MEGA7.0软件构建系统发育树如图7，JZF与蕈状芽孢杆菌Bacillus mycoides亲缘关系最为接近，因此命名为Bacillus mycoidesJZF。
2.3 菌株的生长与产酶曲线
将菌株接种于含木聚糖的液体培养基培养中，绘制生长曲线与产酶曲线如图8，可看出菌株在4～28 h时生长迅速，到28 h时OD600 nm达到最大值，此后菌株生长缓慢，进入稳定期。将菌株接种发酵产酶培养基中，每间隔12 h测定其木聚糖酶活性，由图可知菌株在12～36 h菌株产酶相对缓慢，随着菌体的快速生长，酶活力指数也在快速增加到达72 h时酶活达到最大值为29.65 U/mL，72 h之后酶活力呈现出下降趋势。与之前报道的木聚糖酶活性相比，如陈娜等[23]所得到的木聚糖酶发酵12 h后可到14.58 U/mL，董延娟[24]所得的木聚糖酶活性可达710 U/mL，本研究得到木聚糖酶的活力处在较低水平。
2.4 酶学性质
2.4.1 最适pH
将菌株JZF的粗酶液于不同pH下进行催化反应，检测其酶活性得到最适反应pH，以最大酶活力为100%计算相对酶活，结果如图9。由图9可以看出，菌株JZF粗酶液最适反应pH为9.0，当pH在7.0~10.0内时具备90%以上的酶活性，当pH在3.0～6.0与11.0～12.0内时，保持70%以上的酶活性，现如今大多数木聚糖酶最适pH于6.0～7.0之间，本木聚糖酶最适pH为9，具备碱性木聚糖酶的特征。
2.4.2 pH稳定性
由图10可看出，菌株JZF所产的木聚糖酶在不同pH保持1 h后，在pH为9.0时，该酶具有最强的稳定性，与之前研究的木聚糖酶pH稳定性相比较，如张贝贝等[25]所得的木聚糖酶最适pH为6.0，在3.0~9.0具有一定的稳定性。郑亚伦等[26]源于解淀粉芽孢杆菌的木聚糖酶在pH5.0～7.0条件下培养1 h，残余酶活力能保持在50 %以上具备一定的酸性稳定性，而本研究的木聚糖酶当pH在7.0～9.0内时，仍能够保持60%以上的酶活力，在其余pH条件下酶活力保持在60%以下，具备一定的碱性温度性。
2.4.3 最适温度
将JZF粗酶液于不同温度下催化反应10 min，测定其在对应温度下的酶活性，确定其最适反应温度，以最大酶活为100%计算相对酶活。如图11所示，JZF的粗酶液在20 ℃反应具有85%以上的活性，随着温度的增加，酶活力逐渐升高到达50 ℃时达到最大值，当温度高于50 ℃后酶活力下降迅速，由此可见菌株JZF粗酶液的最适反应温度为50 ℃。
2.4.4 温度稳定性
将该菌的粗酶液分别在40、50、55、60、65、70、80 ℃保温1 h后，检测其酶活力，以最大酶活为100%计算相对酶活，结果见图12。由图12可知，粗酶液在40 ℃下保温具有最好的稳定性，在40～50 ℃处理1 h仍具有90%以上的活性，随着温度上升，酶活力的变化趋势与温度成反相关，当温度高于70 ℃，其保持的相对酶活力已不到70%。
2.4.5 金属离子对酶活影响
在JZF的粗酶液中添加不同的金属离子，检测其酶活力，探究金属离子对其木聚糖酶活力的影响，以不添加金属离子的酶活为100%计算相对酶活，结果如图13所示。由图13可知，Fe2+、Cu2+、Na+、K+、Zn2+、Mg2+对该酶都无促进作用，其中Mg2+、K+对该酶有一定的抑制作用分别为97.02%、94.23%，Mn2+、Ca2+对其具有明显的促进作用分别为144.81%、113.80%。
3. 结论
本研究从银星竹鼠肠道及粪便中，通过液体刚果红褪色法和DNS法筛选出了一株产耐碱性木聚糖酶的菌株JZF，通过形态学观察和分子生物学鉴定，确定该菌株为蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides），酶活可达15.17 U/mL。该菌株在培养28 h后菌体量达到最大值，72 h后木聚糖酶活达到最大值为29.65 U/mL。酶学性质结果表明，蕈状芽孢杆菌JZF所产木聚糖酶最适合反应温度为50 ℃，最适pH9.0；40~60 ℃，pH8.0~9.0条件下相对酶活能保持在60%以上，金属离子Mn2+与Ca2+对该菌株的木聚糖酶有明显的促进作用。
与之前研究所报道的木聚糖酶活性相比较，如姜立春等[27]从腐烂的木材中分离得到的纤维单胞菌属（Celluomonas sp.）其经过优化的木糖酶活性可达到62.8 U/mL。高志强与徐有权等[11,28]分别从土壤样品与南方水稻及腐烂秸秆中中分离的高产木聚糖酶的短小芽孢杆菌（Bacuillus pumilus），其酶活性可达到1166 U/mL与85.12 U/mL。刘维等[29]土壤中筛选的枯草芽孢杆菌（Bacuillus subtillis），酶活达24.40 IU/mL。易旭东等[30]筛选的碱性木聚糖酶产生菌株甲基营养型芽孢杆菌（Bacuillus methylotrophicus）发酵后酶活为28.18 IU/mL。冯波[31]从筛选得到的康氏木霉（Trichoderma koningii）木聚糖酶活性为11.98 IU/g。何敏超等[32]所分离出高产木聚糖酶的黑曲霉（Aspergillus niger），木聚糖酶活性可高达10801.3 IU/g。本研究所得到的木聚糖酶活性较低，大多数报道中的木聚糖酶普遍适用于中性与弱酸性的环境，对于碱性环境适应能力较差，而本研究所得到的木聚糖酶在碱性环境下仍有良好的耐受能力，具备进一步开发利用的潜力。对木聚糖酶的异源表达与分子改造提高其酶活性以及稳定性的研究，也是近年木聚糖酶的研究热点之一[33-35]，后续研究将进一步探究菌株的发酵条件与酶的异源表达研究，为菌株及木聚糖酶的工业化利用提供了一定的数据基础。
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表 1 木聚糖酶酶活测定
Table 1 Xylanase activity assay
菌株编号 木聚糖酶活（U/mL） JZ3 14.77±0.5592 JZ6 12.18±0.3304 JZ8 12.54±0.1249 JZ11 13.13±0.2481 JZA 14.79±0.3758 JZC 11.77±0.07580 JZB 13.37±0.2274 JZE 11.75±0.1033 JZF 15.17±0.3658 JZG 12.56±0.2006 
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