近年来以植物蛋白质粉为主体的特医类保健食品发展迅速。大豆蛋白以其优质的氨基酸组成，蛋白质消化率校正的氨基酸分数（PDCAAS）达到最大值1的人体消化利用率^[1]，成为最主要的植物蛋白质原料。1999年12月，美国食品药品监督管理局（FDA）提出“每日摄入25 g大豆蛋白，可减少心脏病发生的风险”^[2]。除此之外，大豆蛋白被认为具有预防癌症、预防骨质疏松、降低胆固醇、预防高血压、减肥等功效^[3]。高温脱脂豆粕加工的大豆蛋白粉具有不含抗营养因子，大豆熟豆香味浓郁，不产生工业废水，不产生工业废渣的生产优势，同时该大豆蛋白粉不含油脂，含有丰富的大豆膳食纤维，大豆低聚糖以及大豆异黄酮等保健功能成分适合各类人群食用，特别适用于需要改善肠道功能，减肥等需求的人群。因此利用高温脱脂豆粕生产可食用大豆蛋白粉具有巨大的市场前景和价值。

目前生产的高温脱脂豆粕的含水量一般较高，约12%左右，同时存在抗营养因子和微生物不易控制的难题。微波处理能够实现物料的内部加热，干燥速率快。同时微波能够起到杀菌的作用，作用原理主要为热效应和非热生物效应^[4]，与传统的热力杀菌相比，微波杀菌具有加热时间短、升温速度快、杀菌均匀、穿透力强、节约能源、加热效率高、适用范围广等特点^[5]。微波效应能够促进蛋白质的热变性及生化反应^[6]，从而改善与蛋白成分相关的抗营养因子的活性，改善可食用性。目前微波广泛应用于各类食品的干燥和杀菌中^[7-9]，并且在果蔬灭酶中的应用也逐渐受到学者的重视^[10-12]。通过微波处理可一站式实现高温脱脂豆粕的快速干燥、灭菌、灭酶，提高产品的品质，但目前未有相关报道。

本文将对高温脱脂豆粕进行微波处理时间研究，分析微波时间对高温脱脂豆粕的含水量、微波后温度、菌落总数、脲酶活性、溶水后的颜色、大豆蛋白二级结构的影响，进而指导大豆蛋白粉专用的高温脱脂豆粕的生产及应用。

1.   材料与方法

1.1   材料及仪器

高温脱脂豆粕　其中粗蛋白51.3%，粗脂肪1.2%，膳食纤维14.2%，克东禹王大豆蛋白食品有限公司；浓硫酸　分析纯，烟台远东精细化工有限公司；氢氧化钠　分析纯，北京益利精细化学品有限公司；硫酸铜、丙酮　分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；无水乙醚　分析纯，格里斯（天津）医药化学技术有限公司；95%乙醇　天津市津东天正化学试剂厂；重铬酸钾　分析纯，茂名市雄大化工有限公司；三羟甲基氨基甲烷　分析纯，河南比爱欧生物科技有限公司；2-（N-吗啉代）乙烷磺酸　分析纯，翌圣生物科技（上海）股份有限公司。

AL204-2C电子天平　梅特勒-托利多有限公司；LW-20 HMW微波设备　山东立威微波设备有限公司；LHS-150-A恒温培养箱、HWS-26恒温水浴锅　上海一恒科学仪器有限公司；Vortex 1旋涡振荡器　广州仪科实验室技术有限公司；机器视觉色彩分析系统：Panasonic WV-CP470 摄像头　松下电器（中国）有限公司；Grablink Full XR图像采集卡　Euresys有限公司；MAGNA-IR560傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）系统　美国尼高力公司。

1.2   实验方法

1.2.1   微波处理方式及条件

微波处理设备示意图如图1，该设备配置有红外温度测定仪，可实时测定最后的物料温度，通过实时记录计算平均值，同时可控制传输速度。使用聚四氟乙烯微波物料盒长×宽×高=400 mm×400 mm×50 mm，高温脱脂豆粕物料量厚度20 mm，质量（1600±0.5）g。传送带宽度1000 mm，微波场长度6000 mm，物料盒放置于传送带中心位置，微波功率20 kW，风速2.5 m/s。传送带控制传送速度，根据传送速度调整处理时间分别为4.29、4.62、5.00、5.45、6.00 min。处理后密封冷却至室温，测量样品为物料盒中心9个点取样，如图2所示。

图  1  微波处理设备示意图

Figure  1.  Schematic diagram of microwave processing equipment

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图  2  取样点位置

Figure  2.  Sample collection point

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1.2.2   含水量及干燥速率的测定

高温脱脂豆粕的含水量的测定参考GB 5009.3-2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》的方法进行。在大气压下（101.3 kPa），将处理的高温脱脂豆粕放入105 ℃的恒温干燥箱内，干燥至试样质量不再发生变化时结束干燥。每次结果取3个平行实验的平均值。

干燥速率计算公式为：

式中，w₀为初始含水量（%）；w₁为干燥后的含水量（%）；t₁为干燥时间（min）；${\mathrm{v}}_{1}$为干燥速率（%/min）。

1.2.3   菌落总数的测定

高温脱脂豆粕菌落总数的测定参考《GB 4789.2-2016食品安全国家标准食品微生物学检验-菌落总数测定》的方法进行。通过考察菌落总数减少量（初始菌落总数与微波处理后的菌落总数的差值）验证微波处理的杀菌效果。

1.2.4   溶水后的颜色的测定

大豆蛋白粉专用的高温脱脂豆粕最终产品水溶后的颜色直接影响产品的感官可接受程度。微波处理高温脱脂豆粕的过程可发生羰氨反应产生诱人色泽，但处理过度会产生褐色物质，因此考察不同微波时间对其水溶液的颜色影响是评价微波效应的重要因素之一。取高温脱脂豆粕使用万能粉碎机粉碎，过100目筛，取（10±0.1）g放入250 mL烧杯中，加25 ℃纯水200 mL，放入磁力搅拌器中600 r/min搅拌10 min，倒入直径30 mm的烧杯中，使用机器视觉色彩分析系统检测色值。

1.2.5   脲酶活性的测定

高温脱脂豆粕脲酶活性的测定参考GB 5413.31-2013《婴幼儿食品和乳品中脲酶的测定》方法，使用机器视觉色彩分析系统检测色值。

1.2.6   傅里叶红外光谱（FTIR）测定蛋白质二级结构

FTIR的测定参照齐宝坤等^[13]的方法。将1 mg大豆高温脱脂豆粕样品与100 mg溴化钾研磨均匀后压片，置于红外光谱仪中测定。波数扫描范围500~4000 cm⁻¹，扫描次数64次，波数精度0.01 cm⁻¹，分辨率4 cm⁻¹，测定温度25 ℃。利用PeakfitVersion4.12软件谱图拟合处理，根据其峰面积计算蛋白质各二级结构含量。

1.3   数据处理

所有的实验至少进行3次实验，利用SPSS16.0软件对数据进行ANOVA差异显著性分析，P<0.05为显著性差异。采用Origin 2020、PeakFit 4.12等软件分析进行数据分析、图表处理及图谱分析处理。

2.   结果与分析

2.1   不同微波处理时间对样品温度的影响

通过对原始含水量为11.1%的高温脱脂豆粕进行微波处理，得到的不同微波时间下样品的温度变化如图3。

图  3  不同微波时间的温度变化

注：不同小写字母表示差异显著（P<0.05），图4、图5同。

Figure  3.  Changes of temperature in different microwave treatment time

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由图3可以看出随着微波时间的延长，高温脱脂豆粕的结束温度呈增加趋势，微波结束温度与微波时间呈线性关系：y=14.635x+22.985。该关系式的R²达到了0.9879，拟合可信度极高。6 min时温度达到110 ℃。

微波温度是微波效应的直接体现，因物料状态的不均匀性，造成含水量的不均衡性，吸收微波能的能力不同，造成了微波处理后物料温度的不均衡性^[14-17]，微波温度过高会增加局部物料过热的概率，高温脱脂豆粕富含大豆蛋白和碳水化合物，过高的温度可以促进羰氨反应的进行继而产生红色到深褐色的物质，同时发生各种风味变化^[18-19]，是权衡大豆蛋白粉专用高温脱脂豆粕溶水后的颜色与风味的关键控制参数。通过对产品分析发现在温度控制在100~110 ℃时综合评价最好，因此建议生产时微波温度控制在100~110 ℃。

2.2   不同微波处理时间对干燥速率的影响

通过对原始含水量为11.1%的高温脱脂豆粕进行微波处理，得到的不同微波时间的含水量的关系如图4。

图  4  不同微波时间的含水量变化

Figure  4.  Changes of moisture in different microwave treatment time

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由图4可以看出随着时间的延长含水量呈下降趋势。含水量与微波时间呈线性关系：y=−1.5102x+14.842，说明原始含水量11.1%的高温脱脂豆粕在微波4~6 min时间内干燥速率呈恒速干燥阶段，干燥速率为1.51%/min，该关系式的R²达到了0.9815，拟合可信度极高。在微波功率20 kW，料层厚度20 mm，风速2.5 m/s的条件下，微波6 min含水量达到5.88%，根据产品微生物控制需要，市场一般要求高温脱脂豆粕控制在7%以下，根据拟合关系，此时的微波时间为5.19 min。

高温脱脂豆粕的含水量决定了大豆蛋白粉含水量，将高温脱脂豆粕的含水量控制在7%以下是生产大豆蛋白粉的关键工艺参数。微波功率、料层厚度、微波时间决定了微波的干燥速率^[20]，通过前期的微波处理能力及均匀性的实验确定了微波的功率和料层厚度，微波时间相较于微波功率和料层厚度的可操作性及影响更大，因此在微波功率、料层厚度一定的情况下，研究微波时间对干燥速率的影响对高温脱脂豆粕工业化生产具有指导意义。

2.3   不同处理时间对菌落总数的影响

通过对原始含水量为11.1%的高温脱脂豆粕进行微波处理，得到的不同微波时间的菌落总数减少量的关系如图5。

图  5  不同微波时间的菌落总数减少量变化

Figure  5.  Changes of total bacterial count reduction in different microwave treatment time

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微波杀菌效果受热效应和生物学效应的综合影响，Zeng等^[21]认为高强度微波会导致酵母细胞死亡，主要是由于微波可造成不可逆的电解质、Ca²⁺和DNA的渗出。孙震等^[22]认为微波致金黄色葡萄球菌死亡的原因主要是改变了细胞膜的通透性。由图5可以看出随着时间的延长菌落总数减少量呈增加趋势。原始菌落总数为3100 CFU/g的样品，经过4.29 min微波处理后菌落总数减少量为2550 CFU/g，菌落总数减少到550 CFU/g；随着微波时间的延长菌落总数下降的速度逐渐降低，在4.29~4.62 min区间内微波杀菌效果较好，5.45 min后不再变化。分析认为，5.45~6.0 min区间不再变化的原因为在微波处理后期微波的非热生物学效应几乎完成，热效应占主导地位，物料本身微生物基数不断下降，热效应也逐渐衰弱。限于对物料整体风味及颜色的影响，微波处理时间没有再延长。微波5.45 min时，基于菌落总数的评价，微生物的杀灭率达到96.8%，菌落总数达到100 CFU/g，完全符合各类食品，保健品甚至口服药用的要求。

2.4   不同微波处理时间的水溶液颜色变化

大豆蛋白粉专用的高温脱脂豆粕最终产品水溶后的颜色直接影响产品的感官可接受程度。微波处理的高温脱脂豆粕不可避免的存在羰氨反应过程，因此考察不同微波时间对其水溶液的颜色影响是评价微波效应的重要因素之一，对工业化生产具有切实的指导意义，不同微波处理时间的高温脱脂豆粕水溶液颜色变化见表1。

表  1  微波处理时间对高温脱脂豆粕水溶液颜色的影响

Table  1.  The effect of microwave treatment time on the color of the aqueous solution of high-temperature defatted soybean meal

时间 （min）	0	4.29	4.62	5.00	5.45	6.00
L	70.1±1.21e	69.8±0.98e	68.5±0.87d	65.4±1.02c	64.2±0.94b	61.9±0.76a
a	4.3±0.32a	8.6±0.81b	9.3±0.84c	9.1±0.73c	9.3±1.01c	12.4±1.08d
b	18.4±1.95a	20.3±1.11b	21.3±1.34c	23.1±1.67d	26.5±2.23e	30.7±2.27f
注：同行不同小写字母表示差异显著（P<0.05），表2同。

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微波处理前后及过程中高温脱脂豆粕水溶液的L值总体呈降低的趋势，但是幅度较小，视觉感官上表现为颜色变暗，微波6 min时较明显。从a值上看，未微波的样品水溶液红色值最低，随着微波时间的延长，水溶液颜色逐渐变红，4.62 min时出现一个平台期，直到5.45 min时红色基本不变，维持到9左右，6 min时变红较明显。从b值上看，黄色值呈逐渐增加的趋势，特别是从5.45 min到6 min区间，变黄趋势明显增加。分析原因主要是微波处理后温度不断升高，温度越高羰氨反应速度越快，在5.45 min时结果最好，超过6 min后颜色变暗，甚至发黑，存在着火的风险未再持续试验，因此在生产中温度控制到5.45 min为宜。

2.5   不同处理时间的脲酶活性的变化

大豆中含有脲酶和胰蛋白酶抑制剂，在加工用于生产大豆蛋白粉的高温豆粕过程中需要对两种物质进行灭活。脲酶和胰蛋白酶抑制剂的失活程度与热作用呈正相关^[23]，因此检测高温脱脂豆粕的脲酶活性既能检测脲酶的含量，又能反映胰蛋白酶抑制剂的活性，是一种经济高效的检测大豆抗营养因子的方法。通过对原始水分为11.1%的高温脱脂豆粕进行微波处理后，按照国标GB 5413.31-2013的方法检测，得到的不同微波时间脲酶检测结果的颜色变化，通过机器视觉系统进行L, a, b颜色空间分析结果如表2。

表  2  脲酶活性颜色L，a，b值

Table  2.  L, a, b value for urease activity

时间（min）	未处理	4.29	4.62	5.00	5.45	6.00	空白
L	54.2±1.23a	67.8±1.23b	68.4±2.01b	68±2.01b	67.9±4.01b	68±2.12b	67±3.35b
a	15.6±1.18b	0.4±0.72a	−2.2±0.81a	−1.5±0.71a	−2.1±0.93a	−1.7±0.64a	−2.1±0.58a
b	66±3.32d	70.2±2.81e	45.4±3.52c	32.9±2.98b	26.6±2.22a	25.1±4.10a	27.7±3.13a

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脲酶活性检测结果如图6，未经微波处理的高温脱脂豆粕样品为次强阳性（橘红色），经微波处理4.29 min的样品为阳性（深金黄色），4.62 min的为弱阳性（淡黄色），经微波处理时间>5 min的样品为阴性（同色或低于对照样）。

图  6  微波处理时间对高温脱脂豆粕的脲酶活性检测颜色的影响

Figure  6.  The effect of microwave treatment time on color for urease activity detection of high-temperature defatted soybean meal

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通过微波处理能够有效的抑制高温脱脂豆粕的脲酶活性，这与部分学者对多种植物来源的物料中的多酚氧化酶的研究结果一致^[24]。

通过L，a，b颜色模式分析发现，微波处理后的样品L值均在67左右，而次强阳性的未处理样品明显偏低，低约19%左右，L值表示颜色的亮度，L值越高说明颜色越亮，次强阳性的高温豆粕L值与阳性至阴性的样品相比差异显著（P<0.05），可考虑作为区分次强阳性和阳性的特征参数参考；微波处理后的样品a值相差不大，都在−2.2至0.4之间，但是未经微波处理的样品a值达到15.6，a值是正值表示颜色为红色，且a值越高红色越重，红色值高代表脲酶活性高，按照GB 5413.31-2013的判定标准红色值是次强阳性的重要标志；在红色值上能够有效地区分次强阳性和阳性；微波处理后的样品b值差异明显，除未微波处理的次强阳性外，微波处理的b值越高，黄色值越高，越接近阳性，b值≤45时表现为弱阳性，随着微波时间的延长超过5 min后黄色值与空白对照相当，次强阳性的b值略低于阳性的样品，可能是因为红色值太高造成的黄色值检测受到影响。

2.6   蛋白的二级结构分析

FTIR能够提供高温豆粕中大豆蛋白质分子的酰胺I带、酰胺II带、酰胺III带、蛋白质环状结构中的C-C振动和C-O-O糖苷键振动的波段信息^[25]，结果如图7所示。其中酰胺I带（1600～1700 cm⁻¹）的吸光度与蛋白质的二级结构之间存在一定的对应关系^[26]。通过对FTIR谱图分析依次进行分段、基线校正、去卷积处理、二阶导数拟合处理，经多次拟合后可获得酰胺I带的图谱，不同微波时间处理的高温豆粕的FTIR谱图如图7所示，通过计算各子峰积分面积得到二级结构4种类型的相对含量。各子峰与二级结构的对应关系为：1610～1640 cm⁻¹为β-折叠，1640～1650 cm⁻¹为无规卷曲，1650～1660 cm⁻¹为α-螺旋，1661～1700 cm⁻¹为β-转角^[27]。

图  7  不同微波处理时间的高温豆粕FTIR图

注：a. 未处理；b. 4.29 min；c. 4.62 min；d. 5.00 min；e. 5.45 min；f. 6.00 min。

Figure  7.  Infrared spectra of high-temperature defatted soybean meal at different microwave treatment time

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蛋白质红外光谱的峰位迁移和键吸收的能量有关^[28]，从图8可以看出相对于未处理原样（图8（a）），微波处理4.29~6.00 min过程中（图8b~f），其1622 cm⁻¹位置峰迁移了+7~+14 cm⁻¹说明蛋白质分子展开，β折叠结构减小，位移趋势是先增加后减小；1659 cm⁻¹位置峰迁移了−1~+9 cm⁻¹，表明蛋白质α螺旋结构先减少后增加，且在微波处理4.29~5.45 min时（图8b~e）该峰值位置跨过α螺旋峰值位置；1675 cm⁻¹位置峰迁移了+10~+19 cm⁻¹，整体趋势先增加后减少，表明蛋白质β转角结构先增加后减少^[29]。这些结果说明微波处理能够使得蛋白质有序结构向无序结构的转变^[30]。

图  8  不同微波处理时间的高温豆粕的酰胺I带变化

注：a. 未处理；b. 4.29 min；c. 4.62 min；d. 5.00 min；e. 5.45 min；f. 6.00 min。

Figure  8.  Changes of amide I band of high-temperature defatted soybean meal subjected to different microwave treatment time

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不同微波处理的高温豆粕中大豆蛋白质二级结构的相对含量如图9所示。其中β-折叠相对含量变化较小，微波处理后β-折叠与未处理的相比下降4.2个百分点，随着微波处理时间的增加，β折叠先增加后降低，在5 min时（图8d）达到最大值51.69%，在6 min时（图8f）达到最低值44.78%；α螺旋在微波处理4.29 min（图8b）时消失；在5.45 min至6 min之间时（图8e~f）出现并迅速增加，在6 min时（图8f）达到49.63%；β转角经微波处理后迅速增加，在4.29 min时由未处理的19.3%增加到51.72%（图8b），到5.45 min（图8e）之前变化不大，但是在6 min时（图8f）迅速降低至5.59%。可见微波处理的效率高，对蛋白二级结构的影响迅速。分析认为微波处理初期α螺旋迅速向β转角转化，进而消失，β转角量快速增加，结合酰胺I带变化，各二级结构的峰值移动与上述变化一致，而β折叠变化幅度较小，相对稳定，分析原因可能为通过微波处理大豆蛋白吸收微波能后，键能增加，同时产生热效应，引起蛋白分子的二级结构发生变化。微波后期，特别是在5.45至6 min之间（图8e~f）结构变化较快，β转角迅速向α螺旋转化，表现在颜色上迅速褐变，豆香味明显增加，分析原因可能为随着微波处理时间的增加发生羰氨反应，发生醇醛、醛胺缩合与氨基酸共价交联导致二级结构构象发生变化。与大豆分离蛋白、大豆11S等蛋白^[13,31]明显不同，高温豆粕没有无规则卷曲的吸光度，分析认为高温豆粕加工过程中是在低温环境下利用有机溶剂脱除油脂后干燥制得，蛋白分子受到细胞结构的保护因此没有产生无规则卷曲。白明昧等^[32]研究认为β-折叠含量与蛋白质溶解度和体外消化率呈极显著负相关，α-螺旋的含量与蛋白质体外消化率呈正相关。因此微波处理，特别在试验条件下处理5.45 min的产品，能够改善高温豆粕的消化率，提高产品的品质。

图  9  不同微波处理时间的高温豆粕中蛋白质二级结构的相对含量

Figure  9.  Relative content of protein secondary structure of high-temperature soybean meal at different microwave treatment time

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3.   结论

通过研究不同的微波处理时间对大豆高温脱脂豆粕影响发现，利用微波处理能够快速有效地降低高温脱脂豆粕的含水量，可提高高温脱脂豆粕干燥效率，节约干燥时间，提高生产产能。通过微波处理可以有效地降低大豆高温脱脂豆粕的菌落总数，因此微波处理，特别在试验条件下处理5.45 min的产品，能够改善高温豆粕的消化率，提高产品的品质。微波处理后蛋白的二级结构出现较明显的峰移，没有产生无规则卷曲，β折叠相对变化较小，而β转角和α螺旋的相互转化明显，这与大豆分离蛋白的二级结构存在较大的差异，由此带来的营养及保健价值有待进一步研究验证。微波处理高温脱脂豆粕无论是在含水量控制，微生物控制、外观，还是抗营养因子控制方面均有较大的工业化应用前景。