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多肽类ACE抑制剂的设计合成及生物活性

周佳琪, 马春燕, 李晓晖

周佳琪，马春燕，李晓晖. 多肽类ACE抑制剂的设计合成及生物活性[J]. 食品工业科技，2022，43（23）：26−34. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022030117.
引用本文: 周佳琪，马春燕，李晓晖. 多肽类ACE抑制剂的设计合成及生物活性[J]. 食品工业科技，2022，43（23）：26−34. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022030117.
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ZHOU Jiaqi, MA Chunyan, LI Xiaohui. Design, Synthesis and Bioactivity of Polypeptide ACE Inhibitors[J]. Science and Technology of Food Industry, 2022, 43(23): 26−34. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022030117.
Citation: ZHOU Jiaqi, MA Chunyan, LI Xiaohui. Design, Synthesis and Bioactivity of Polypeptide ACE Inhibitors[J]. Science and Technology of Food Industry, 2022, 43(23): 26−34. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022030117.
shu

多肽类ACE抑制剂的设计合成及生物活性

  • 1.

    大连理工大学生物工程学院，辽宁大连 116024

  • 2.

    大连理工大学化工学院，辽宁大连 116024

详细信息
    作者简介:

    周佳琪（1997−），女，硕士研究生，研究方向：功能性多肽药物的设计与合成，E-mail：jqzhoudut@163.com

    通讯作者:

    李晓晖（1964−），女，博士，教授，研究方向：多肽药物研究，E-mail：lxhxh@dlut.edu.cn

  • 中图分类号: TS201.1

Design, Synthesis and Bioactivity of Polypeptide ACE Inhibitors

  • 1.

    College of Bioengineering, Dalian University of Technology, Dalian 116024, China

  • 2.

    College of Chemical Engineering, Dalian University of Technology, Dalian 116024, China

HTML全文

    摘要
  • 摘要: 本研究以血管紧张素I转化酶（angiotensin converting enzyme, ACE）抑制肽PHP1和PHP2为研究母肽，通过替换氨基酸残基改变目标多肽的疏水性、带电性等因素，利用生物信息学工具评估多肽潜在的生物活性，设计了19个多肽类似物。采用多肽固相合成法合成目的多肽类似物，并进行体外生物活性检测。结果显示多肽类似物均具有较高的ACE抑制活性，其中，PHP1A-6（IC50=3.87 μmol/L）、PHP2A-3（IC50=3.33 μmol/L）、PHP2A-4（IC50=2.86 μmol/L）和PHP2A-7（IC50=4.58 μmol/L）的ACE抑制活性最高，较母肽有显著提高（P<0.05），PHP1A-3、PHP1A-4、PHP1A-7、PHP2A-1和PHP2A-10具有同母肽相当的抑制活性，IC50<10 μmol/L。绝大部分多肽类似物的α-葡萄糖苷酶抑制活性与母肽相比均有明显提高，PHP1A-3（IC50=3.09 μmol/L）、PHP1A-7（IC50=9.51 μmol/L）、PHP2A-6（IC50=5.58 μmol/L）、PHP2A-11（IC50=2.35 μmol/L）和PHP2A-12（IC50=3.98 μmol/L）的活性最高。其中，PHP1A-3和PHP1A-7具备较强的ACE抑制和α-葡萄糖苷酶抑制双重活性。含Cys的多肽类似物在1 mg/mL浓度下，ABTS + · 清除率均在85%以上，具备潜在的抗氧化活性。分子对接研究了ACE抑制肽与ACE的构效关系，表明抑制肽可以与ACE的氨基酸残基产生多个稳定的氢键、疏水相互作用、π-π堆积及盐桥，增加了对ACE的抑制作用。
    Abstract: In this study, using angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory peptides PHP1 and PHP2 as the parent peptides, the hydrophobicity and electrical properties of target polypeptides were altered by substituting amino acid residues. In addition, the potential bioactivity of these polypeptides was assessed using bioinformatics tools. Following this analysis, 19 polypeptide analogues were designed and synthesized using solid-phase synthesis, and their bioactivities were detected in vitro. The results revealed that the polypeptide analogues showed relatively high ACE inhibitory activities, PHP1A-6 (IC50=3.87 μmol/L), PHP2A-3 (IC50=3.33 μmol/L), PHP2A-4 (IC50=2.86 μmol/L), and PHP2A-7 (IC50=4.58 μmol/L) exhibited the highest ACE inhibitory activity levels, significantly higher than the parent peptides (P<0.05). PHP1A-3, PHP1A-4, PHP1A-7, PHP2A-1 and PHP2A-10 displayed equal levels of inhibitory activity in comparison to the parent peptides (IC50<10 μmol/L). Compared with the parent peptides, the α-glucosidase inhibitory activity levels demonstrated by most of the polypeptide analogues were significantly enhanced, PHP1A-3 (IC50=3.09 μmol/L), PHP1A-7 (IC50=9.51 μmol/L), PHP2A-6 (IC50=5.58 μmol/L), PHP2A-11 (IC50=2.35 μmol/L), and PHP2A-12 (IC50=3.98 μmol/L) exhibited the highest activities. Additionally, PHP1A-3 and PHP1A-7 displayed relatively strong inhibitory activity against both ACE and α-glucosidase. At concentrations of 1 mg/mL, the polypeptides containing Cys displayed an ABTS+· scavenging rate of higher than 85%, demonstrating a potential antioxidant activity. The structure-activity relationship between the ACE inhibitory peptides and ACE were explored using molecular docking. The results reflected that inhibitory peptides produced multiple stable hydrogen bonds, hydrophobic interactions, π-π stacking interactions, and salt bridges with ACE amino acid residues, thereby improving the inhibitory effects exerted on ACE.
    • HTML全文

  • 高血压是一种高发性心血管疾病，全世界近10亿人患有高血压，预计到2025年，高血压患病人数将达到15.6亿[1-2]。在血压复杂调节网络中，血管紧张素I转换酶（angiotensin converting enzyme, ACE, EC 3.4.15.1）作为一种关键酶，通过肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin system, RAS）和激肽释放酶-激肽系统（kallikrein-kinin system, KKS）参与血压调节[3-4]。在RAS中，ACE可催化血管紧张素I转化为能够使血管收缩的血管紧张素II[5]，而在KKS中，ACE能够切割缓激肽C-端的二肽残基，导致其失去血管扩张的功能，造成血压升高[6-7]。因此，抑制ACE一直是治疗高血压的一种有效方法。目前市面上已有降压药，降压效果强，但在服用后往往会对人体产生副作用[8-10]。然而，具备ACE抑制功效的生物活性肽由于分子量小，易吸收，无毒副作用，安全性高等特点[11-12]，具有研发降压药物的潜力。

    ACE是一种锌金属蛋白酶，具有C-端和N-端两个功能结构域，C-端结构域包括3个催化活性位点S1、S1’和S2，S1活性口袋包含Ala354、Glu384和Tyr523；S2包含Gln281、His353、Lys511、His513和Tyr520；S1’包含Glu162，三个位点均具备疏水性特征[13]。大多数ACE抑制肽都作用于其C-端结构域[14]，ACE抑制肽序列中疏水氨基酸残基的含量，在一定程度上决定了其ACE抑制活性[15]。ACE的3个活性位点有各自亲和的氨基酸残基，S1亲和Pro和芳香族氨基酸；S1’亲和Val、Ala和Leu；S2亲和Ile[16-17]。多肽C-末端3个氨基酸残基的改变对ACE抑制活性影响较大[18]。研究表明多肽C-末端第2个氨基酸为Lys或Arg时对ACE的抑制活性会有所提高[19-20]。此外，当多肽的N-端含疏水性氨基酸Ala、Leu、Ile和Val时，能够促进多肽与ACE催化活性位点的结合。

    目前，合成得到的许多多肽类ACE抑制剂已被证明具有良好的ACE抑制活性，例如，Ashok等[21]使用固相合成法合成了水牛初乳蛋白中的ACE抑制肽GIPLPLI（IC50为74 μmol/L）。Mirzaei等[13]通过固相合成4种YR-10（YGKPVAVPAR，来源于酿酒酵母蛋白）的多肽类似物，筛选出较YR-10 ACE抑制活性更高YHR-10（YGKHVAVHAR），并进一步研究了合成肽YHR-10的结构与功能关系，发现通过除去YR-10 N-末端的Tyr和C-末端的Arg得到的GA-8（GKPVAVPA），ACE抑制活性降低了3.31倍。此外，Deng等[22]设计了10种抗氧化肽LWHTH（来源于海鞘组织）的多肽类似物，经过固相合成得到的多肽类似物CWHTH不仅具备抗氧化活性，还发现其对ACE表现出了良好的抑制作用。

    虽然近年来已有大量动物源ACE抑制肽被分离鉴定，但大量抑制肽仍具有提升ACE抑制活性的空间。定向改造多肽不仅能够发掘高活性多肽，也可以了解多肽性质与功能的联系。丙氨酸扫描文库技术是一种有价值的方法，已被广泛应用于多肽的构效关系研究中[23]。同时，随着生物信息学的快速发展，大量的多肽信息被储存于数据库中并且建立了多肽分析及活性预测工具，利用这些工具可以快速筛选生物活性肽。

    本研究前期从猪血红蛋白源多肽（Pig Hemoglobin Peptide, PHP）中筛选出了2条ACE抑制肽：PHP1（VVYPWT）和PHP2（TKTYFPHF），IC50分别为7.42和5.33 μmol/L[24-25]，具备较高的ACE抑制活性，但这2条ACE抑制肽的构效关系尚未明确。因此，本文以PHP1和PHP2作为研究母肽，利用丙氨酸扫描文库技术结合生物活性预测工具对研究母肽进行定向改造，设计新型多肽类ACE抑制剂，筛选高ACE抑制活性多肽，研究多肽序列中氨基酸疏水性、带电性及空间位阻等性质对其活性的影响，探索构效关系，同时发掘具备多种生物活性的ACE抑制肽，为开发多功能性的多肽产品提供新的思路。

    1.   材料与方法

    1.1   材料与仪器

    Fmoc-Thr（tBu）-王树脂、Fmoc-Phe-王树脂、Fmoc-氨基酸、Boc-氨基酸、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐（O-Benzotriazole-N,N,N',N'-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate, HBTU）、1-羟基苯并三唑（1-Hydroxybenzotriazole, HOBt）、N，N’-二异丙基乙胺（N,N'-Diisopropylethylamine, DIEA）、三异丙基硅烷（Triisopropylsilane, TIS） 吉尔生化（上海）有限公司；乙腈　色谱纯，美国TEDIA；血管紧张素Ⅰ转换酶（ACE，源自兔肺，酶活力≥2.0 U/mg蛋白）、N-[3-（2-呋喃基）丙烯酰基]-Phe-双甘氨酸（N-[3-（2-furyl）acryloyl]-L-phenylalanyl-glycyl-glycine, FAPGG）　Sigma公司；4-羟乙基哌嗪乙磺酸（2-[4-（2-hydroxyethyl）piperazin-1-yl]ethanesulfonicacid, HEPES）　阿拉丁试剂有限公司；α-葡萄糖苷酶（酶活力1 kU/13.2 mg）　北京索莱宝科技有限公司；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside, p-NPG）　上海源叶生物科技有限公司；总抗氧化能力试剂盒　上海碧云天试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

    岛津LC-20A型高效液相色谱仪、岛津LC-20AP制备型高效液相色谱仪　日本岛津公司；YMC-Pack ODS-A（4.6 mm×150 mm，粒度5 µm）分析色谱柱　日本YMC公司；Agilent ZORBAX SB-C18（21.2 mm×150 mm，粒度5 µm）制备色谱柱、Agilent 1260/6130型液质联用仪　美国Agilent公司；HXGL-10-50B型冷冻干燥机　上海沪析实业有限公司；Molecular Devices多功能读板机　美国Thermo公司；100 mL G-2固相合成反应管　日本Cosumosubiido株式会社。

    1.2   实验方法

    1.2.1   多肽类似物的设计及生物信息学分析
    1.2.1.1   多肽类似物的设计

    利用丙氨酸扫描文库技术结合生物活性预测工具PeptideRanker筛选母肽PHP1及PHP2的可突变位点。根据氨基酸的疏水性、带电性和空间位阻，将母肽PHP1及PHP2序列中部分氨基酸残基进行替换，设计多肽类ACE抑制剂类似物序列。

    1.2.1.2   多肽类似物的生物信息学分析

    多肽的理化性质预测：使用ExPASy（https://www.expasy.org/）的ProtParam分析工具分析多肽的各项理化参数，包括理论等电点、净电荷、疏水性残基比率、半衰期[26]等。

    多肽的生物活性、毒性预测：利用BIOPEP-UWM（https://biochemia.uwm.edu.pl/biopep-uwm/）的Bioactivity prediction模块中的AHTpin平台预测设计的多肽类似物是否具备ACE抑制活性[27]。利用Bioware生信分析工具（http://bioware.ucd.ie/~compass/biowareweb/）的PeptideRanker模块预测多肽的潜在生物活性[28]。利用ToxinPred数据库（http://crdd.osdd.net/raghava/toxinpred/index.html）预测多肽的毒性[29]。

    1.2.2   多肽的固相合成及纯化
    1.2.2.1   固相合成目标肽

    利用固相合成法合成目标肽，多肽链C-末端的氨基酸（amino acid，aa）固定于王树脂（即Fmoc-aa-王树脂），以该氨基酸的氨基端作为合成起点，根据多肽从C-端到N-端的合成顺序，通过氨基酸间的脱水缩合使下一位氨基酸偶联到树脂上，直到目标肽N-末端最后一个氨基酸反应完为止，实现将目标肽链连接到树脂上，随后切割树脂，得到目标肽。具体合成步骤如下：

    溶胀Fmoc-aa-王树脂：取1 g Fmoc-aa-王树脂，装入固相合成器中，移取15 mL二氯甲烷（Dichloromethane, DCM）加入其中等待15 min，使树脂得到充分膨润，随后抽滤除去DCM。

    脱除氨基保护基Fmoc：加入15 mL体积分数为20%的哌啶/N,N-二甲基甲酰胺（N,N-Dimethylformamide，DMF）搅拌反应30 min后抽滤，用DCM和异丙醇反复洗涤并抽干，取出微量树脂，通过Kaiser法检测树脂颜色变化，以此来监测反应进程，若树脂呈现蓝紫色，说明Fmoc已除去，氨基酸的氨基暴露，可进行下一步反应。

    目标肽的产生：将Fmoc-氨基酸（2 eq）和缩合试剂HBTU（2 eq）、HOBt（2 eq）依次溶于DMF中，加入到固相合成器中，加入氨基酸活化试剂DIEA（4 eq），搅拌反应1.5 h，经DCM和异丙醇洗涤，参照Kaiser法[30]监测反应进程，由此实现肽链的延长。重复上述脱除Fmoc和肽链延长步骤过程，直至接入目标肽N-末端最后一个由Boc/Fmoc保护的氨基酸，至此侧链及N-端保护的目标肽连接到了树脂上。若最后一个氨基酸由Fmoc保护，则先脱除Fmoc，再进行下一步操作。

    树脂及保护基的切割：将合成完毕的肽链-树脂用15 mL DCM溶胀后抽滤，加入15 mL三氟乙酸（trifluoroacetic acid, TFA）/TIS/H2O（体积比 95:2.5:2.5），常温下反应1.5~2.5 h，取出反应液旋蒸干燥，倒入冰乙醚结晶，待乙醚挥发完全加入甲醇溶解样品，旋蒸干燥后加入冰乙醚再次结晶，取沉淀减压干燥，得到多肽粗品。

    1.2.2.2   目标肽的纯化

    RP-HPLC制备精制：ZORBAX SB-C18制备色谱柱，流动相A：0.1% TFA/水，B：0.1% TFA/乙腈；洗脱条件：流动相B在0～20 min，梯度变化为30%～80%；220 nm波长检测，流速20.0 mL·min−1；进样0.5 mL，柱温30 ℃。产物经真空冷冻干燥处理后经质谱鉴定分子量。

    RP-HPLC纯度分析：YMC-Pack ODS-A分析色谱柱，流动相A：0.1% TFA/水，B：0.1% TFA/乙腈；洗脱条件：流动相B在0～15 min，梯度变化为30%～80%；检测波长220 nm，流速1.0 mL·min−1；进样10 µL，柱温30 ℃。

    1.2.3   多肽的体外生物活性测定
    1.2.3.1   ACE抑制活性测定

    根据文献[31]的方法测定ACE抑制活性。首先，FAPGG用含有300 mmol/L NaCl的80 mmol/L HEPES缓冲液（pH8.3）配制成1 mmol/L的溶液。精确称取多肽样品4 mg，用缓冲液配制成2000 μg/mL，稀释到400、80、16、3.2、0.64 μg/mL不同浓度，取这6个浓度梯度的样品溶液进行实验，做3组平行。取40 μL样品和50 μL FAPGG溶液混匀，随后加入10 μL的ACE溶液（0.1 U/mL），立即置于340 nm下检测吸光度，随后放入培养箱，37 ℃下孵育，待反应30 min后再次检测吸光度。HEPES缓冲液作为空白对照组，在同等条件下测定反应前后吸光度差值。计算对ACE的抑制率达到50%时的多肽浓度IC50，ACE抑制率的计算公式如下：

    ACE抑制率(%)=B−AB×100
    		 (1)

    式中：A为样品组反应前后的吸光度差值；B为空白对照组反应前后吸光度差值。

    1.2.3.2   α-葡萄糖苷酶抑制活性测定

    对α-葡萄糖苷酶的抑制活性测定采用优化的Xu等[32]的方法。精确称取多肽样品4 mg，用PBS缓冲液配制成2000 μg/mL，稀释到1000、100、10、1、0.1 μg/mL不同浓度，取这6个浓度梯度的样品溶液进行实验，做3组平行。取20 μL p-NPG溶液（9 mmol/L）与20 μL样品溶液混匀，37 ℃下孵育10 min，随后加入20 μL α-葡萄糖苷酶溶液（0.2 U/mL），37 ℃下反应20 min，反应结束后立即加入150 μL Na2CO3溶液（0.1 mmol/L）终止反应，于405 nm处测定吸光度。采用下方公式计算α-葡萄糖苷酶抑制率：

    抑制率(%)=Α2−Α1Α2−Α0×100
    		 (2)

    式中：A1为样品、酶和p-NPG混合液的吸光值；A2为缓冲液代替样品溶液的吸光值；A0为缓冲液代替酶溶液后混合物的吸光值。

    1.2.3.3   抗氧化活性测定

    采用ABTS法[22]表征多肽样品的抗氧化活性，具体操作方法参照总抗氧化能力试剂盒的说明。储备溶液包括ABTS溶液和氧化剂溶液，将两者等量混合，室温避光存放16 h得到ABTS工作母液，用80%乙醇稀释得到ABTS工作液，于734 nm下测定吸光度（工作液吸光值-空白对照吸光值=0.7±0.05）。用80%乙醇将多肽样品配制成1 mg/mL的溶液。将200 μL ABTS工作液加入96孔板的检测孔中，随后加入10 μL样品溶液并混匀，室温孵育2~6 min，测定A734。蒸馏水作空白对照，Trolox作阳性对照。ABTS自由基清除率计算公式如下：

    ABTS自由基清除率(%)=B−AB×100
    		 (3)

    式中：A为加入样品和ABTS的吸光值；B为不加样品，加入ABTS的吸光值。

    1.2.4   多肽与ACE的分子对接

    从PDB数据库中下载ACE-Lisinopril复合物的晶体结构（PDB ID：1O8A），使用Pymol软件对其进行预处理，删除Lisinopril配体，去水，加氢，得到ACE蛋白分子。使用ChemBioDrawUltra 14.0绘制多肽分子，之后利用ChemBio 3D Ultra 14.0对多肽进行能量最小化处理，得到多肽小分子空间构象。利用AutoDockVina软件打开处理过的ACE大分子和多肽小分子，将其分别设置为受体和配体，设置对接盒子，选择半柔性对接方式，进行20次对接。分析对接结合能，选取对接结果中的最佳构象，使用Pymol软件和Protein-Ligand Interaction Profiler在线工具进一步分析。

    1.3   数据处理

    采用软件SPSS 16.0对实验数据进行分析处理，数值用均值±标准差表示，每个试验平行三次。

    2.   结果与分析

    2.1   多肽类似物的设计

    以ACE抑制肽PHP1和PHP2为研究母肽，对PHP1和PHP2进行丙氨酸扫描，即用丙氨酸逐一替换多肽序列中的非丙氨酸残基，构建丙氨酸扫描文库。得到的14种多肽片段通过PeptideRanker进行生物活性预测，发现PHP1序列第3、4、5位的Tyr、Pro、Trp和PHP2序列第4、5、6、8位的Tyr、Phe、Pro、Phe分别用Ala替换后，预测活性明显降低，说明母肽序列中处于这些位置的原氨基酸残基改变可能会导致其活性的降低甚至丧失。因此，本研究在设计新型多肽类ACE抑制剂时，保留母肽序列中这些位置的氨基酸残基，改变其他位置的氨基酸残基，设计的19个多肽类似物见表1。

    表  1  PHP1、PHP2及其类似物的序列
    Table  1.  Sequence of PHP1, PHP2 and their analogues
    名称序列名称序列
    PHP1Val-Val-Tyr-Pro-Trp-ThrPHP2Thr-Lys-Thr-Tyr-Phe-Pro-His-Phe
    PHP1A-1Cys-Val-Tyr-Pro-Trp-ThrPHP2A-1Thr-Lys-Leu-Tyr-Phe-Pro-His-Phe
    PHP1A-2Val-Cys-Tyr-Pro-Trp-ThrPHP2A-2Ile-Lys-Leu-Tyr-Phe-Pro-His-Phe
    PHP1A-3Val-Val-Tyr-Pro-Trp-PhePHP2A-3Ala-Lys-Leu-Tyr-Phe-Pro-His-Phe
    PHP1A-4Cys-Val-Tyr-Pro-Trp-PhePHP2A-4Ile-Ala-Leu-Tyr-Phe-Pro-His-Phe
    PHP1A-5Val-Cys-Tyr-Pro-Trp-PhePHP2A-5Ala-Ala-Leu-Tyr-Phe-Pro-His-Phe
    PHP1A-6Gly-Val-Tyr-Pro-Trp-PhePHP2A-6Ala-Ala-Leu-Tyr-Phe-Pro-Leu-Phe
    PHP1A-7Val-Ala-Tyr-Pro-Trp-PhePHP2A-7Ala-Lys-Ala-Tyr-Phe-Pro-Arg-Phe
    −−PHP2A-8Gly-Lys-Leu-Tyr-Phe-Pro-His-Phe
    −−PHP2A-9Ile-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-His-Phe
    −−PHP2A-10Gly-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-His-Phe
    −−PHP2A-11Gly-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-Leu-Phe
    −−PHP2A-12Gly-Lys-Gly-Tyr-Phe-Pro-Arg-Phe
    注：PHP1/2A（Analogue of Pig Hemoglobin Peptide 1/2，猪血红蛋白源多肽1/2的类似物）。
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    优化PHP1第1、2、6位氨基酸残基：将母肽PHP1序列中第1和2位Val残基替换为带巯基的Cys，分别得到多肽类似物PHP1A-1和PHP1A-2；将母肽PHP1、PHP1A-1和PHP1A-2序列中的C-端Thr残基替换为强疏水性的芳香族氨基酸Phe，分别得到PHP1A-3、PHP1A-4和PHP1A-5；在PHP1A-3基础上，将序列中第1、2位的Val残基，分别用空间位阻小的Gly和Ala替换，得到PHP1A-6和PHP1A-7。

    优化PHP2第1、2、3、7位氨基酸残基：将母肽PHP2序列中第3位的Thr残基变为疏水性强的Leu，得到PHP2A-1；将PHP2A-1中的第1位Thr残基替换为疏水性强的Ile和Ala，分别得到PHP2A-2和PHP2A-3；在PHP2A-2和PHP2A-3基础上，将序列中第2位带正电荷的Lys残基替换为不带电荷且具有疏水性的Ala，得到PHP2A-4和PHP2A-5；将PHP2A-5序列第7位带正电荷的His替换为不带电荷的Leu，得到PHP2A-6；将PHP2A-3序列第3位的Lue替换为Ala，第7位的His残基用带有胍基的Arg替换，得到PHP2A-7；将PHP2A-3~PHP2A-7中的Ala残基替换为侧链更小的Gly，得到PHP2A-8~PHP2A-12。

    2.2   多肽的理化性质

    PHP1和PHP2及多肽类似物的各项理化性质如表2所示。PHP1系列的等电点均在5.5左右，PHP2系列的等电点在5.5~10之间。总平均亲水性指数（GRAVY）是多肽中氨基酸残基亲水值总和的平均值，正值越大疏水性越强，负值越大亲水性越强，PHP1及类似物都是疏水性多肽，PHP2系列中，PHP2A-12亲水性最强，PHP2A-6疏水性最强。脂肪族氨基酸指数（Aliphatic index）可作为多肽的热稳定性指标，指数越高热稳定性越高，PHP1、PHP1A-3、PHP2A-2、PHP2A-4、PHP2A-6、PHP2A-9及PHP2A-11的热稳定性相对较高。非稳定性指数（Instability index）是多肽稳定性的参考数值，指数<40被定义为稳定性多肽，除PHP2A-11外，其余序列均为稳定性多肽。半衰期（Half-life）预测结果表明N-端氨基酸残基的改变对多肽在细胞内的半衰期影响较大，C-端氨基酸残基改变对其影响较小。

    表  2  PHP1、PHP2及其类似物的理化性质
    Table  2.  Physicochemical properties of PHP1, PHP2 and their analogues
    名称pIGRAVY净电荷脂肪族氨基酸指数非稳定性指数半衰期（h）生物活性预测分数
    mammalian reticulocytesYeast cellE.coli
    PHP15.490.650096.67−13.52100>20>100.50
    PHP1A-15.520.367048.33−26.081.2>20>100.82
    PHP1A-25.490.367048.33−0.95100>20>100.82
    PHP1A-35.491.233096.6711.53100>20>100.83
    PHP1A-45.520.950048.33−1.301.2>20>100.91
    PHP1A-55.490.950048.3324.10100>20>100.98
    PHP1A-65.520.467048.3311.5330>20>100.98
    PHP1A-75.490.833065.0024.10100>20>100.97
    PHP28.29−0.725+10.0019.867.2>20>100.60
    PHP2A-18.29−0.163+148.759.257.2>20>100.76
    PHP2A-28.600.487+197.50−1.36200.5>100.87
    PHP2A-38.640.150+161.259.254.4>20>100.92
    PHP2A-46.741.2000110.0019.86200.5>100.92
    PHP2A-56.780.863073.7519.864.4>20>100.95
    PHP2A-65.571.7380122.5032.834.4>20>100.97
    PHP2A-79.99−0.263+225.0023.404.4>20>100.95
    PHP2A-88.60−0.125+148.75−1.3630>20>100.94
    PHP2A-96.740.925097.5019.86200.5>100.93
    PHP2A-106.740.312048.7535.2930>20>100.96
    PHP2A-115.521.188097.5048.2530>20>100.98
    PHP2A-129.99−0.812+20.00−8.4430>20>100.96
    注：mammalian reticulocytes：哺乳动物的红细胞；Yeast cell：酵母细胞；E.coli：大肠杆菌。
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    PeptideRanker预测得出的生物活性分数代表了多肽具备生物活性的可能性大小，阈值为0.5，即任何预测超过0.5阈值的多肽都被认为具备潜在的生物活性，预测结果显示多肽类似物均具有潜在的生物活性，且绝大多数肽具有较高的活性分数，结果见表2。此外，AHTpin平台预测设计的多肽类似物均具备ACE抑制活性，ToxinPred预测所有设计的多肽均没有毒性。

    2.3   多肽的合成纯化与体外生物活性

    如表3所示，通过多肽固相合成法合成了母肽及其类似物，并通过反相高效液相进行了分析及纯化，目标多肽经纯化后的纯度均在95%以上。经质谱确定目的多肽分子量与理论分子量一致。

    表  3  合成肽的生物活性
    Table  3.  Bioactivity of synthetic peptides
    名称（MW m/z）RP-HPLCACE IC50
    （μmol/L）    		α-Glucosidase IC50
    （μmol/L）    		ABTS+·清除率
    （%）
    Calcd.[M+H]+Rt（min）Purity（%）
    PHP1763.39764.45.55998.316.34±0.378897.09±1.795.80±0.51
    PHP1A-1767.33768.35.25198.6720.25±5.54**116.03±1.09**95.89±0.43**
    PHP1A-2767.33768.25.22799.7336.66±7.90**88.87±1.74**89.76±1.22**
    PHP1A-3809.41810.47.36099.678.48±0.783.09±0.43**8.18±0.69
    PHP1A-4813.35814.57.39197.978.64±1.92104.46±1.79**94.00±0.28**
    PHP1A-5813.35814.47.32998.9513.34±2.2854.49±2.39**85.53±4.26**
    PHP1A-6767.36768.46.98499.843.87±0.21*331.95±2.60**10.10±0.59**
    PHP1A-7781.38782.46.48399.579.67±0.429.51±0.25**12.00±1.21**
    PHP21039.511040.510.16998.048.64±0.14296.79±2.1427.73±0.37
    PHP2A-11051.551052.26.53398.149.48±1.061889.59±1.30**23.28±1.11**
    PHP2A-21063.591064.28.47495.8040.06±2.84**1872.49±1.12**25.73±0.50*
    PHP2A-31021.541022.46.57298.493.33±0.34**306.32±3.76**25.53±1.30*
    PHP2A-41006.531007.59.81797.432.86±0.46**278.23±1.71**28.54±0.69
    PHP2A-5964.48965.18.37098.3558.11±2.30**21.24±2.32**35.43±1.52**
    PHP2A-6940.51941.512.75298.2333.93±2.87**5.58±0.88**37.62±0.28**
    PHP2A-7998.53999.110.99598.154.58±0.57*7949.34±0.96**18.47±1.47**
    PHP2A-81007.521008.46.27298.4815.18±2.72**957.91±1.71**23.14±0.60**
    PHP2A-9992.51993.49.86698.1125.13±1.86**90.82±1.27**30.44±1.15**
    PHP2A-10936.45937.38.19297.738.22±1.021022.05±1.97**28.60±0.84
    PHP2A-11912.47913.210.33999.2911.08±1.472.35±0.27**29.88±1.32*
    PHP2A-12970.50971.34.13499.8724.94±2.71**3.98±0.25**21.49±1.73**
    注：Rt为多肽在液相分析图中的保留时间；PHP1系列设计肽与PHP1比较，PHP2系列设计肽与PHP2比较，“*”代表差异显著（0.01<P<0.05），“**”代表差异极显著（P<0.01）。
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    母肽PHP1、PHP2及其多肽类似物的ACE抑制活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗氧化活性结果如表3所示。

    ACE抑制活性结果表明PHP1A-6、PHP2A-3、PHP2A-4、PHP2A-7的抑制活性最高，IC50分别为3.87、3.33、2.86和4.58 μmol/L，PHP1A-6、PHP2A-7与母肽活性相比差异显著（P<0.05），PHP2A-3、PHP2A-4与母肽活性相比差异极显著（P<0.01），它们的抑制活性比母肽高2~3倍；PHP1A-3、PHP1A-4、PHP1A-7、PHP2A-1和PHP2A-10具有同母肽相当的抑制活性。多肽类似物改变N-端氨基酸残基会导致抑制活性发生较大变化，Liu等[33]指出多肽N-端氨基酸的改变会影响食物来源ACE抑制肽的活性。在PHP1系列设计肽中，N-端使用疏水性更弱的Cys替换Val（PHP1A-1、PHP1A-2），衍生肽活性与母肽相比显著降低；在PHP2系列设计肽中，N-端Thr和Lys替换成疏水性更强的Ile或Leu或Ala得到的PHP2A-1、PHP2A-3、PHP2A-4有较高的ACE抑制活性。表明疏水性对不同多肽ACE抑制活性会产生不同的影响，在多肽序列N-端含有Val、Leu、Ala、Ile等疏水性氨基酸时，多肽与ACE活性中心的结合效率有所增强，从而增加了对ACE的抑制活性[34]。

    PHP1系列设计肽中，N-端氨基酸Val用空间位阻小的Gly或Ala替代后具有高ACE抑制活性；而在PHP2系列设计肽中，N-端氨基酸Thr或Lys用空间位阻小的Gly或Ala替代后仍能够保持良好的ACE抑制活性，体现了多肽中氨基酸空间位阻的变化对ACE抑制活性有影响[35]。PHP2系列多肽带电性与ACE抑制活性没有明显的相关性。

    多肽C-端氨基酸的改变也会对活性产生影响。当酪蛋白和羊奶乳清提取多肽的C-端三个氨基酸中存在Pro时，会提高其ACE抑制活性[36]，芳香族氨基酸Phe、Tyr、Trp的存在也会增强多肽对ACE的抑制作用[37]。本研究设计多肽的C-端三肽中保留了原有的Pro或将C-端的Thr替换为Phe后，设计肽仍能保持与母肽相当的活性。此外，PHP2序列中的His替换为Leu会降低ACE抑制活性，PHP2A-7中Arg的引入对其活性产生了积极影响。本研究发现C-端第二位为His或Arg时对多肽的ACE抑制活性有着非常重要的作用，原因可能是His的咪唑环和Arg的侧链胍基的存在会更有利于多肽与ACE的结合[13]。

    综上所述，多肽序列中氨基酸残基的疏水性、空间位阻及其序列中位置对其ACE抑制活性影响较大。

    α-葡萄糖苷酶抑制活性结果显示，母肽及其多肽类似物的α-葡萄糖苷酶抑制活性与PeptideRanker预测活性接近。母肽PHP1的α-葡萄糖苷酶抑制作用不明显，PHP2的抑制活性IC50为296.79 μmol/L。PHP1系列多肽类似物抑制活性较母肽都有明显提高，其中，PHP1A-3和PHP1A-7的IC50分别为3.09，9.51 μmol/L，它们具备高活性的原因分析是肽段C-端含有的Phe增加了多肽的疏水性，因此增加了α-葡萄糖苷酶抑制活性。与PHP1A-3比较发现，PHP1A-7的序列N-端用Ala替代序列中的Val后，多肽的活性降低了，这与研究发现的高活性的α-葡萄糖苷酶抑制肽往往是高度疏水的，多肽中的强疏水性氨基酸Val、Ile、Leu及Phe、Pro、Ala等疏水氨基酸残基更易与α-葡萄糖苷酶的氨基酸残基结合，从而发挥对α-葡萄糖苷酶抑制的结论一致[38-40]。分析认为多肽N-端疏水性强具有更高的α-葡萄糖苷酶抑制作用。

    研究表明，高α-葡萄糖苷酶抑制活性多肽的净电荷多为0或+2[41]，本研究中PHP2系列设计肽中除PHP2A-7和PHP2A-10外，其余净电荷为0或+2的多肽活性较母肽均有显著提高，表明净电荷可能与PHP2系列设计肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性有关。与PHP2A-3相比，Ala、Arg替换Leu、His得到的PHP2A-7降低了多肽疏水性，可能是导致其α-葡萄糖苷酶抑制活性降低的原因；同样的，与PHP2A-9相比，用Gly替换Ile得到的PHP2A-10抑制活性也较母肽有所降低。

    多肽类似物PHP2A-6、PHP2A-11和PHP2A-12表现出了最高的α-葡萄糖苷酶抑制活性，IC50分别为5.58、2.35和3.98 μmol/L，较母肽有极显著性提高（P<0.01），三种多肽类似物均具有潜在的降血糖活性。Arise等[42]发现多肽中Leu含量高可能会增加α-葡萄糖苷酶抑制活性，PHP2A-6、PHP2A-11序列中含有2个Leu可能是其具备高活性的原因。多肽序列中氨基酸空间位阻的变化与其α-葡萄糖苷酶抑制活性没有相关性。

    综上所述，多肽序列中氨基酸的疏水性、净电荷及其序列中位置对其α-葡萄糖苷酶抑制活性影响较大。

    抗氧化活性表明，多肽浓度为1 mg/mL时，含有Cys的多肽类似物PHP1A-1、PHP1A-2、PHP1A-4和PHP1A-5的ABTS+·清除率均较高，与母肽相比差异极显著（P<0.01），这是因为Cys上的巯基使得多肽具备强的抗氧化能力[43]，本研究发现当Cys残基处于肽链N-端第1位比在2位时具有更好的抗氧化能力，可能是由于Cys处于末端时，多肽巯基基团更易与自由基接触产生反应。研究表明多肽序列中存在Leu、Pro、Phe、Ala等疏水性氨基酸有利于提高抗氧化活性，可能是疏水性氨基酸作为供氢体与ABTS+·反应，提高了多肽的自由基清除能力[44]。PHP2A-5和PHP2A-6的抗氧化活性较母肽有所提高，这可能与Ala替换了Thr、Lys，Leu替换了His，保留了序列中的Pro、Phe，提高了多肽的疏水性有关。

    2.4   ACE抑制肽-ACE的分子对接

    ACE抑制活性较高的PHP1A-6、PHP2A-3、PHP2A-4和PHP2A-7分别与ACE进行分子对接，对接结果经Pymol软件分析抑制肽与ACE的氨基酸残基之间形成的氢键情况（如图1）。经Protein-Ligand Interaction Profiler分析抑制肽与ACE疏水相互作用、π-π堆积及盐桥。

    图  1  ACE与多肽类似物的复合物模型
    Figure  1.  The models of ACE in complex with the peptide analogues
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    PHP1A-6与ACE的Asn277（2.9 Å）、Ala354（3.2 Å）、Glu376（2.8 Å）、Glu376（2.9 Å）、Asp377（2.9 Å）、Glu384（3.0 Å）、Asp453（2.7 Å）、Lys454（3.0 Å）之间形成8个氢键，其中，Ala354、Glu384在ACE的S1活性口袋中，PHP1A-6进入ACE活性口袋，C-端和N-端氨基酸残基都与ACE产生了氢键相互作用，其中N-端Gly让出了更大的空间使得肽链中其余氨基酸残基与ACE产生了氢键。PHP1A-6与ACE的Thr166、Trp279、Glu376、Val379、His383、Phe512、Val518、Tyr523之间存在疏水相互作用。PHP1A-6中Trp的吲哚基与His383的咪唑环之间形成了π-π堆积作用。PHP1A-6的C-端羧基与His383、His387之间形成了盐桥。

    PHP2A-3与ACE的Glu162（3.0 Å）、Gln281（3.1 Å）、Thr282（2.7 Å）、His353（3.1 Å）、Glu376（2.9 Å）、His513（2.7 Å）、Tyr523（2.7 Å）之间形成7个氢键。PHP2A-3与Ala354、Trp357、Val379、Val380、His383、Phe457、Phe512、Val518、Tyr523、Phe527之间产生疏水相互作用。PHP2A-3中Tyr的芳香环与His387之间形成了π-π堆积作用。

    PHP2A-4与ACE的Glu162（2.8 Å）、Thr282（2.8Å）、His353（3.2 Å）、His513（2.9 Å）、Tyr523（2.8 Å）之间形成5个氢键。PHP2A-4与Ala354、Asp358、Tyr360、Val379、Val380、His383、Phe391、Phe457、Phe512、Val518、Tyr523、Phe527之间产生疏水相互作用。PHP2A-4中Tyr的芳香环与His387之间形成了π-π堆积。

    PHP2A-7与ACE的Glu162（3.1 Å）、Thr282（2.8 Å）、His353（3.1 Å）、Glu376（2.9 Å）、Asp377（3.0 Å）、His513（2.7 Å）、Tyr523（2.7 Å）之间形成7个氢键。PHP2A-7与Trp279、Thr282、Ala354、Trp357、Val379、Val380、His383、Phe457、Phe512、Val518、Tyr523、Phe527之间产生疏水相互作用。PHP2A-7中Tyr和Phe的芳香环与His383、His387产生了π-π堆积作用。肽链中的Arg与Glu162、Glu376、Asp377作用形成了盐桥。

    PHP2A-3、PHP2A-4及PHP2A-7主要与S1活性口袋中的Tyr523，S2的His353，His513，S1’形成了氢键相互作用。PHP2A-3、PHP2A-4和PHP2A-7主要是其N-端高疏水性氨基酸残基与ACE之间产生了疏水相互作用，C-端氨基酸与ACE的部分氨基酸残基之间产生了氢键、肽链中的Tyr和Phe与ACE的His387形成了π-π堆积，PHP2A-7的Arg还与ACE之间产生了盐桥，从而发挥较强的ACE抑制作用，因此，证明了PHP2系列多肽N-端氨基酸残基疏水性强会增加对ACE抑制活性，并且保留C-端的Phe和Pro及引入Arg对ACE的抑制起到了积极的作用。

    3.   结论

    本研究以ACE抑制肽PHP1和PHP2为母肽，经丙氨酸扫描诱变结合生物活性预测筛选出了母肽序列中的可突变位点并对其进行氨基酸替换，设计了19个新型ACE抑制肽类似物。生物信息学分析结果显示，多肽类似物均具备潜在的生物活性且无毒性。通过固相合成法合成了母肽及其类似物，产物经RP-HPLC纯化和分析后的纯度均在95%以上。ESI-MS鉴定目的多肽分子量与理论分子量一致。通过验证新型多肽的体外生物活性，表明氨基酸残基的疏水性、空间位阻及其序列中位置对ACE抑制活性影响较大，多肽的N-端疏水性越强，ACE抑制作用越强，当N-端氨基酸替换为空间位阻小的Gly和Ala时，多肽的ACE抑制活性变强。对新型多肽分子和ACE进行分子对接，多肽抑制剂与ACE之间形成多个氢键、疏水相互作用、π-π堆积和盐桥，增加了对ACE的抑制作用。综上，本研究设计的多肽类似物均具有较高的ACE抑制活性，其中，PHP1A-6、PHP2A-3、PHP2A-4和PHP2A-7的ACE抑制活性较母肽有显著性提高（P<0.05），PHP1A-3、PHP1A-4、PHP1A-7、PHP2A-1和PHP2A-10具有同母肽相当的抑制活性，其余多肽类似物的ACE抑制活性较母肽有所降低，IC50介于10~60 μmol/L范围内。绝大部分多肽类似物的α-葡萄糖苷酶抑制活性与母肽相比均有明显提高，PHP1A-3、PHP1A-7、PHP2A-6、PHP2A-11和PHP2A-12的α-葡萄糖苷酶抑制作用最强。其中，PHP1A-3和PHP1A-7具备较强的ACE抑制和α-葡萄糖苷酶抑制双重活性，具有进一步研究价值。多肽类似物中含有Cys的片段具有较高的ABTS+·清除率，具备潜在的抗氧化活性。

  • 图  1   ACE与多肽类似物的复合物模型

    Figure  1.   The models of ACE in complex with the peptide analogues

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    表  1   PHP1、PHP2及其类似物的序列

    Table  1   Sequence of PHP1, PHP2 and their analogues

    名称序列名称序列
    PHP1Val-Val-Tyr-Pro-Trp-ThrPHP2Thr-Lys-Thr-Tyr-Phe-Pro-His-Phe
    PHP1A-1Cys-Val-Tyr-Pro-Trp-ThrPHP2A-1Thr-Lys-Leu-Tyr-Phe-Pro-His-Phe
    PHP1A-2Val-Cys-Tyr-Pro-Trp-ThrPHP2A-2Ile-Lys-Leu-Tyr-Phe-Pro-His-Phe
    PHP1A-3Val-Val-Tyr-Pro-Trp-PhePHP2A-3Ala-Lys-Leu-Tyr-Phe-Pro-His-Phe
    PHP1A-4Cys-Val-Tyr-Pro-Trp-PhePHP2A-4Ile-Ala-Leu-Tyr-Phe-Pro-His-Phe
    PHP1A-5Val-Cys-Tyr-Pro-Trp-PhePHP2A-5Ala-Ala-Leu-Tyr-Phe-Pro-His-Phe
    PHP1A-6Gly-Val-Tyr-Pro-Trp-PhePHP2A-6Ala-Ala-Leu-Tyr-Phe-Pro-Leu-Phe
    PHP1A-7Val-Ala-Tyr-Pro-Trp-PhePHP2A-7Ala-Lys-Ala-Tyr-Phe-Pro-Arg-Phe
    −−PHP2A-8Gly-Lys-Leu-Tyr-Phe-Pro-His-Phe
    −−PHP2A-9Ile-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-His-Phe
    −−PHP2A-10Gly-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-His-Phe
    −−PHP2A-11Gly-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-Leu-Phe
    −−PHP2A-12Gly-Lys-Gly-Tyr-Phe-Pro-Arg-Phe
    注：PHP1/2A（Analogue of Pig Hemoglobin Peptide 1/2，猪血红蛋白源多肽1/2的类似物）。
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    表  2   PHP1、PHP2及其类似物的理化性质

    Table  2   Physicochemical properties of PHP1, PHP2 and their analogues

    名称pIGRAVY净电荷脂肪族氨基酸指数非稳定性指数半衰期（h）生物活性预测分数
    mammalian reticulocytesYeast cellE.coli
    PHP15.490.650096.67−13.52100>20>100.50
    PHP1A-15.520.367048.33−26.081.2>20>100.82
    PHP1A-25.490.367048.33−0.95100>20>100.82
    PHP1A-35.491.233096.6711.53100>20>100.83
    PHP1A-45.520.950048.33−1.301.2>20>100.91
    PHP1A-55.490.950048.3324.10100>20>100.98
    PHP1A-65.520.467048.3311.5330>20>100.98
    PHP1A-75.490.833065.0024.10100>20>100.97
    PHP28.29−0.725+10.0019.867.2>20>100.60
    PHP2A-18.29−0.163+148.759.257.2>20>100.76
    PHP2A-28.600.487+197.50−1.36200.5>100.87
    PHP2A-38.640.150+161.259.254.4>20>100.92
    PHP2A-46.741.2000110.0019.86200.5>100.92
    PHP2A-56.780.863073.7519.864.4>20>100.95
    PHP2A-65.571.7380122.5032.834.4>20>100.97
    PHP2A-79.99−0.263+225.0023.404.4>20>100.95
    PHP2A-88.60−0.125+148.75−1.3630>20>100.94
    PHP2A-96.740.925097.5019.86200.5>100.93
    PHP2A-106.740.312048.7535.2930>20>100.96
    PHP2A-115.521.188097.5048.2530>20>100.98
    PHP2A-129.99−0.812+20.00−8.4430>20>100.96
    注：mammalian reticulocytes：哺乳动物的红细胞；Yeast cell：酵母细胞；E.coli：大肠杆菌。
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    表  3   合成肽的生物活性

    Table  3   Bioactivity of synthetic peptides

    名称（MW m/z）RP-HPLCACE IC50
    （μmol/L）    		α-Glucosidase IC50
    （μmol/L）    		ABTS+·清除率
    （%）
    Calcd.[M+H]+Rt（min）Purity（%）
    PHP1763.39764.45.55998.316.34±0.378897.09±1.795.80±0.51
    PHP1A-1767.33768.35.25198.6720.25±5.54**116.03±1.09**95.89±0.43**
    PHP1A-2767.33768.25.22799.7336.66±7.90**88.87±1.74**89.76±1.22**
    PHP1A-3809.41810.47.36099.678.48±0.783.09±0.43**8.18±0.69
    PHP1A-4813.35814.57.39197.978.64±1.92104.46±1.79**94.00±0.28**
    PHP1A-5813.35814.47.32998.9513.34±2.2854.49±2.39**85.53±4.26**
    PHP1A-6767.36768.46.98499.843.87±0.21*331.95±2.60**10.10±0.59**
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    PHP21039.511040.510.16998.048.64±0.14296.79±2.1427.73±0.37
    PHP2A-11051.551052.26.53398.149.48±1.061889.59±1.30**23.28±1.11**
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    PHP2A-31021.541022.46.57298.493.33±0.34**306.32±3.76**25.53±1.30*
    PHP2A-41006.531007.59.81797.432.86±0.46**278.23±1.71**28.54±0.69
    PHP2A-5964.48965.18.37098.3558.11±2.30**21.24±2.32**35.43±1.52**
    PHP2A-6940.51941.512.75298.2333.93±2.87**5.58±0.88**37.62±0.28**
    PHP2A-7998.53999.110.99598.154.58±0.57*7949.34±0.96**18.47±1.47**
    PHP2A-81007.521008.46.27298.4815.18±2.72**957.91±1.71**23.14±0.60**
    PHP2A-9992.51993.49.86698.1125.13±1.86**90.82±1.27**30.44±1.15**
    PHP2A-10936.45937.38.19297.738.22±1.021022.05±1.97**28.60±0.84
    PHP2A-11912.47913.210.33999.2911.08±1.472.35±0.27**29.88±1.32*
    PHP2A-12970.50971.34.13499.8724.94±2.71**3.98±0.25**21.49±1.73**
    注：Rt为多肽在液相分析图中的保留时间；PHP1系列设计肽与PHP1比较，PHP2系列设计肽与PHP2比较，“*”代表差异显著（0.01<P<0.05），“**”代表差异极显著（P<0.01）。
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出版历程
  • 收稿日期:  2022-03-09
  • 网络出版日期:  2022-10-08
  • 刊出日期:  2022-11-30

目录

摘要
HTML全文

  • 1.   材料与方法

  • 1.1   材料与仪器

  • 1.2   实验方法

  • 1.2.1   多肽类似物的设计及生物信息学分析
  • 1.2.1.1   多肽类似物的设计
  • 1.2.1.2   多肽类似物的生物信息学分析
  • 1.2.2   多肽的固相合成及纯化
  • 1.2.2.1   固相合成目标肽
  • 1.2.2.2   目标肽的纯化
  • 1.2.3   多肽的体外生物活性测定
  • 1.2.3.1   ACE抑制活性测定
  • 1.2.3.2   α-葡萄糖苷酶抑制活性测定
  • 1.2.3.3   抗氧化活性测定
  • 1.2.4   多肽与ACE的分子对接

  • 1.3   数据处理

  • 2.   结果与分析

  • 2.1   多肽类似物的设计

  • 2.2   多肽的理化性质

  • 2.3   多肽的合成纯化与体外生物活性

  • 2.4   ACE抑制肽-ACE的分子对接

  • 3.   结论

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