液相色谱-串联质谱法检测药食两用杂交天麻及其亲本品种中的氨基酸、核苷类成分

王广政; 巩晴晴; 俞年军; 高翰博; 邢丽花; 杜方平

doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022030299

液相色谱-串联质谱法检测药食两用杂交天麻及其亲本品种中的氨基酸、核苷类成分

王广政^{1, 2,},
巩晴晴^{1, 2},
俞年军^{1, 2, 3, 4, 5, ,},
高翰博^{1, 2},
邢丽花^{1, 3},
杜方平⁶

1.
安徽中医药大学药学院，安徽合肥 230012
2.
安徽省中医药科学院中药资源保护与开发研究所，安徽合肥 230012
3.
安徽道地中药材品质提升协同创新中心，安徽合肥 230012
4.
中药研究与开发安徽省重点实验室，安徽合肥 230012
5.
新安医学教育部重点实验室，安徽合肥 230012
6.
金寨县药用菌种植专业合作社，安徽六安 237000

基金项目: 国家自然科学基金联合基金项目（U19A2009）；安徽高校协同创新项目（GXXT-2019-043）；安徽道地中药材品质提升协同创新中心项目（皖教科〔2013〕2号）；安徽省教育厅项目（皖教秘科〔2014〕44 号）；2019年中医药公共卫生服务补助专项“全国中药资源普查项目”（财社〔2019〕43号）。

详细信息

作者简介:
王广政（1998−），男，硕士研究生，研究方向：中药资源与中药质量，E-mail：2054332851@qq.com

通讯作者:
俞年军（1965−），男，硕士，教授，研究方向：中药质量评价，E-mail：ynj2005288@sina.com

中图分类号: TS201.1
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出版历程
- 收稿日期: 2022-03-24
- 网络出版日期: 2022-11-28
- 刊出日期: 2023-01-31

Determination of Amino Acids and Nucleosides in Medicinal and Edible Hybrid Gastrodia elata and Its Parent Varieties Based on Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WANG Guangzheng^{1, 2,},
GONG Qingqing^{1, 2},
YU Nianjun^{1, 2, 3, 4, 5, ,},
GAO Hanbo^{1, 2},
XING Lihua^{1, 3},
DU Fangping⁶

1.
School of Pharmacy, Anhui University of Traditional Chinese Medicine, Hefei 230012, China
2.
Institute of Traditional Chinese Medicine Resources Protection and Development, Anhui Academy of Traditional Chinese Medicine, Hefei 230012, China
3.
Collaborative Innovation Center for Quality Improvement of Daodi Chinese Medicinal Materials, Hefei 230012, China
4.
Anhui Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Research and Development, Hefei 230012, China
5.
Xin'an Medical and Education Ministry Key Laboratory, Hefei 230012, China
6.
Jinzhai County Medicine Mushroom Planting Professional Cooperative, Liuan 237000, China

摘要

摘要: 实验采用超高效液相色谱与质谱联用技术精确检测金寨红乌杂交天麻及其亲本云南乌天麻、金寨红天麻中的氨基酸、核苷类成分，结合统计学方法阐明三个品种天麻之间的氨基酸、核苷类成分组成与含量差异并综合评价，为后续金寨杂交天麻的资源利用与食品开发提供科学依据。C₁₈柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流动相用0.2%甲酸水（A）-乙腈（B），体积流量为0.2 mL/min，柱温30 ℃，梯度洗脱；电喷雾离子源以多反应监测（MRM）模式测定，喷雾电压5500 V；离子化温度550 ℃；离子源气压（Gas）为241.3 kPa，雾化气（GS1）为379.2 kPa，辅助气（GS2）为379.2 kPa。实验结果运用主成分分析（PCA）和优劣解距离法（TOPSIS）进行分析并综合评价。结果显示，31种成分在0~144.58 μg/mL范围内线性关系良好，决定系数R²均大于0.999，精密度、稳定性、重复性峰面积RSD均不大于3.0%，平均回收率92.69%~99.5%，回收率RSD 1.3%~2.9%。天麻内含有丰富的氨基酸与核苷类成分，其中谷氨酸与天门冬氨酸为主要成分，杂交天麻总氨基酸、总核苷含量较亲代天麻更高，且总氨基酸呈显著性差异（P<0.05），PCA与TOPSIS法评价结果也以S1、S2杂交天麻品质最优。该实验为天麻的质量评价建立了新方法，并为金寨杂交品种的推广提供了科学依据。
- 天麻 /
- 液相色谱-串联质谱法 /
- 氨基酸 /
- 核苷 /
- 主成分分析 /
- TOPSIS法 /
- 药食两用 /
- 质量评价
Abstract: To provide a scientific basis for the follow-up resource utilization and food development of Jinzhai hybrid G. elata, the ultra-high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry was utilized to accurately determine the contents of amino acids and nucleosides in Jinzhai Hongwu hybrid Gastrodia elata Bl. and its parents Yunnan G. elata Bl. f. glauca S. Chow and Jinzhai G. elata Bl. f. elata. Statistical methods were also applied to clarify and comprehensively evaluate the composition and content differences in amino acids and nucleosides among the three varieties of G. elata. C₁₈ column (2.1 mm×100 mm, 1.8 μm) was used with 0.2% formic acid water (A)-acetonitrile (B) as the mobile phase at a flow rate of 0.2 mL/min. The column temperature was 30 ℃ with gradient elution. Moreover, electrospray ion source was measured in multiple reaction monitoring (MRM) mode, which was set as spray voltage at 5500 V; ionization temperature at 550 ℃; ion source gas pressure (Gas) at 241.3 kPa, atomizing gas (GS1) at 379.2 kPa, and auxiliary gas (GS2) at 379.2 kPa. The results revealed that there was a good linear relationship in the range of 0~144.58 μg/mL of the 31 components. The coefficient of determination R² was greater than 0.999, and the RSD of the precision, stability, and repeatability of the peak area was not greater than 3.0%. The average recovery rate was between 92.69% and 99.5%, while recovery rate RSD ranged from 1.3% to 2.9%. Based on all above, G. elata was rich in amino acids and nucleotides, of which glutamic acid and aspartic acid were the main components. The contents of total amino acids and nucleosides in hybrid G. elata were higher than those of its parents G. elata. And there was a significant difference in the amino acids contents of different varieties (P<0.05). In the evaluation results of PCA and TOPSIS methods, the qualities of S1 and S2 hybrid G. elata were the best. This paper established a new method for evaluating the quality of G. elata and provided a scientific basis for the development and exploitation of Jinzhai hybrid varieties.
- Gastrodia elata /
- liquid chromatography-tandem mass spectrometry /
- amino acid /
- nucleoside /
- principal component analysis /
- TOPSIS /
- homology of medicine and food /
- quality evaluation

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天麻为兰科植物天麻（Gastrodia elata Bl.）的块茎，因其具有药用以及食用的双重功效而受到消费者的高度关注，国家卫计委在2019年底就将天麻列入《按照传统既是食品又是中药材物质》名单，天麻现已广泛应用于日常饮食以及营养保健中^[1-3]。天麻具有很高的食用价值，含有多种人体必需的营养成分，如氨基酸^[4-8]、核苷^[9-10]、多糖^[11-15]、微量元素^[16-18]、蛋白质^[19-21]等。氨基酸参与体内众多生命活动，其含量已经成为评价药食两用中药质量的关键指标；核苷为核酸的主要组分，另外核苷还作为神经递质，参与调节脑内不同的生理和病理过程。因此研究天麻氨基酸、核苷类等营养成分，明确其营养价值对药食两用天麻品质的提升与质量的控制具有重大意义。

现代学者将天麻划分为乌天麻、红天麻、绿天麻、松天麻、黄天麻5个变型^[22]，目前市场主要流通的天麻品种为云南、贵州乌天麻以及长江、黄河流域的红天麻^[23]。安徽金寨县地处大别山区，自然环境优越，是全国天麻主产区之一。金寨县主要栽培品种为红天麻，当地种植户为提高天麻产量与质量从云南小草坝引种乌天麻与本地红天麻进行杂交，根据杂交优势原理培育出具有亲本优良特性的新品种“红乌天麻”^[24]。周娜^[25]对金寨天麻的栽培情况与质量标准展开研究，发现红乌天麻与亲本红天麻的农艺性状与显微性状呈显著性差异，通过建立指纹图谱得出杂交天麻中天麻素、对羟基苯甲醇含量符合2020版《中国药典》规定。但查阅国内外文献后发现，目前尚未有研究说明金寨杂交品种与其亲本品种之间存在质量差异，杂交红乌天麻除在性状上区别于亲代天麻，其内在质量是否较亲代天麻得到提升，这影响到杂交品种今后的推广种植以及金寨天麻产业的发展。

目前测定氨基酸含量的主要方法是将其柱前或柱后衍生后加入仪器中测定，包括氨基酸分析仪法、高效液相色谱法和毛细管电泳法等^[26-28]，但衍生化操作复杂，衍生物稳定性较差，其衍生效果无法直接判断。而液相色谱-质谱将液相的分离能力与质谱的高灵敏度和选择性相结合，该方法比高效液相色谱更适合于多组分复杂系统的分离和分析，操作简便，结果准确。通过查阅文献，Wang等^[29]建立高效液相-电喷雾串联质谱法同时鉴定出天麻提取物中的15种酚类化合物和6种核苷类成分；Chen等^[4]采用超高效液相色谱串联三级四极杆质谱仪器对不同地区新鲜天麻根茎中的酚类、核苷以及氨基酸类成分进行鉴定并测定含量，结果成功鉴定出4种氨基酸和2种核苷并发现在不同产地采集的天麻样本中检测到的氨基酸存在显著的含量差异。除此外，再未查阅到有关液质联用技术测定天麻氨基酸与核苷的相关学术报告。本文首次采用液质联用技术系统性地对天麻中氨基酸与核苷两类生物活性成分的组成与含量进行测定，旨从营养物质差异方面评价杂交天麻与其亲本品种的品质优劣，为金寨杂交红乌天麻的推广栽培种植提供依据，有利于药食两用天麻的资源开发与利用。

1. 材料与方法

1.1 材料与仪器

3个品种共9批天麻样品（乌天麻、红天麻、红乌天麻）均为实地采集，详细信息见表1。

表 1 天麻样品采集信息

Table 1. Collection information of Gastrodia elata samples

样品编号	采集地点	品种	海拔（m）	栽培方式
S1	安徽金寨班竹园	红乌天麻	581.2	林下
S2	安徽金寨汤家汇	红乌天麻	593.7	林下
S3	安徽金寨双河镇	红乌天麻	554.9	大棚
S4	安徽金寨果子园	红天麻	348.7	大棚
S5	安徽金寨吴家店	红天麻	366.0	大棚
S6	安徽金寨沙河乡	红天麻	273.1	大棚
S7	云南昭通小草坝	乌天麻	1934.2	大棚
S8	云南昭通小草坝	乌天麻	1883.7	大棚
S9	云南昭通小草坝	乌天麻	1745.4	大棚

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实验所用水　为超纯水；甲酸　购于上海阿拉丁工业公司；乙腈　购于安徽天地高纯溶剂有限公司，二者均为色谱级，纯度均≥98%。对照品苏氨酸（B21933）、苯丙氨酸（B21910）、异亮氨酸（B21937）、亮氨酸（B21925）、酪氨酸（B21924）、胱氨酸（B21919）、丙氨酸（B21911）、谷氨酸（B21916）、甲硫氨酸（B21913）、脯氨酸（B21914）、组氨酸（B21938）、天冬氨酸（B21934）、天冬酰胺（B21935）、丝氨酸（B21932）、甘氨酸（B21915）、缬氨酸（B21936）、精氨酸（B21920）、羟脯氨酸（B21928）、色氨酸（B21930）、赖氨酸（B21923）、γ-氨基丁酸（B21979）、尿嘧啶（B20908）、腺嘌呤（B21357）、胞苷（B20073）、鸟嘌呤（B20906）、肌苷（B20582）、胸苷（B30633）、鸟苷（B20905）、腺苷（B21356）、尿苷（B20907）、次黄嘌呤（B20211）、胞嘧啶（B20074）　购于上海源叶公司，纯度均≥98%。

ExionLC AD 超高效液相色谱仪　日本 Shimadzu；ABSciex QTRAP 5500三重四级杆-线性离子肼串联质谱仪　美国SCIEX；PALL -Cascada II纯水机　美国颇尔；AX324ZH电子天平　常州奥豪斯；CENTRIFUGE 5810 R高速离心机　德国艾本德；AS系列超声波清洗机　天津奥特赛恩斯。

1.2 实验方法

1.2.1 标准品溶液制备

精密称取31种待测成分的对照品适量，置于15 mL的离心管中加入超纯水溶解，获得单一成分的标准品溶液，再从各单标溶液中吸取1 mL移至离心管中配制成混合标准品溶液。标准品溶液使用前，用超纯水逐级稀释至所需浓度，过0.22 µm的微孔滤膜后，置于4 ℃环境中保存。

1.2.2 样品的前处理

将采集到的天麻样品洗净，用热水隔水蒸至透心，然后切片置于70 ℃环境下烘干，最后用打粉机粉碎过60目筛备用。精密称定上述处理后的天麻样品粉末1.0 g，置于50 mL离心管中，加入40 mL超纯水，超声（25 ℃，功率200 W，频率40 kHz）处理50 min，过滤后静置，滤液在11000 r/min下离心8 min，吸取上清液过0.22 μm微孔滤膜，最后取滤液上机测定。

1.2.3 测定条件

1.2.3.1 色谱条件

色谱柱为ZORBAX RRHD Eclipse Plus C₁₈（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；将含有0.2%甲酸的水作为流动相A，将乙腈作为流动相B，梯度洗脱（0~4 min，85% B；4~6 min，85%~48% B；6~8 min，48% B；8~9 min，48%~85% B；9~12 min，85% B）；进样体积1 μL，流速0.2 mL/min，柱温30 ℃。

1.2.3.2 质谱条件

在ESI⁺（正离子化）模式下进行多反应监测（MRM）检测；喷雾电压5500 V；离子化温度550 ℃；Gas为241.3 kPa（35 psi），Gas1为379.2 kPa（55 psi），Gas2 为379.2 kPa（55 psi）。另外对碰撞能量、去簇电压以及检测离子对优化处理，优化后的条件参数见表2。

表 2 31种成分测定中优化的质谱条件参数

Table 2. Optimized MS parameters for the determination of 31 components

化合物	保留时间（min）	母离子	子离子	去簇电压（V）	碰撞电压（V）
甘氨酸	5.83	76.04	30.00^*、49.00	73	6
丙氨酸	6.36	90.06	44.02^*、46.78	79	10
丝氨酸	6.18	106.05	59.99^*、74.30	67	8
天门冬氨酸	6.51	134.05	87.96^*、73.80	59	10
天门冬酰胺	4.12	132.80	115.70^*、73.90	46	13
缬氨酸	6.41	118.09	72.06^*、55.06	67	8
谷氨酸	3.46	147.08	83.92^*、130.58	83	14
异亮氨酸	2.98	132.00	86.00^*、69.00	66	15
甲硫氨酸	7.01	150.06	104.03^*、133.00	91	10
精氨酸	6.88	175.12	70.20^*、116.00	88	18
组氨酸	3.52	156.08	110.03^*、93.17	95	16
苏氨酸	3.54	120.30	76.80^*、104.70	54	11
苯丙氨酸	3.55	166.10	120.05^*、103.00	56	14
亮氨酸	6.92	132.10	86.05^*、42.30	98	10
胱氨酸	3.65	240.80	151.90^*、120.00	71	18
羟脯氨酸	4.43	133.80	71.80^*、69.60	52	25
酪氨酸	3.56	182.16	136.08^*、165.10	46	17
色氨酸	5.31	205.00	188.00^*、72.2	202	15
脯氨酸	7.01	116.07	70.02^*、68.03	68	10
赖氨酸	4.29	147.00	84.00^*、130.00	52	24
γ-氨基丁酸	5.68	103.70	86.90^*、87.00	32	14
鸟嘌呤	4.20	151.80	135.00^*、135.00	62	24
腺嘌呤	6.57	136.06	119.00^*、92.00	51	24
尿嘧啶	1.78	113.04	70.00^*、95.00	111	21
次黄嘌呤	6.96	137.05	110.00^*、118.70	46	15
胸苷	5.68	243.10	127.07^*、99.00	61	13
鸟苷	4.21	284.30	152.00^*、135.00	62	15
肌苷	3.34	269.00	137.05^*、137.05	46	15
尿苷	4.21	244.90	113.00^*、70.05	103	13
腺苷	3.47	267.9	118.70^*、135.00	86	23
胞苷	1.54	244.09	94.65^*、111.80	61	10
注：表中“*”标注离子为定量离子。

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1.2.4 定性定量方法

31种待测成分采用试样与标准品溶液间相对保留时间、各成分特征离子与定量离子对应的离子峰相对丰度进行定性。定量方法采用外标法，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合标准曲线，再将实测得到的样品峰面积带入标曲公式中计算各成分含量。

1.2.5 方法学考察

1.2.5.1 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液1 μL，在1.2.3项所得条件下1 d内连续进样6次，计算日内精密度。再连续3 d内重复进样6次，计算日间精密度。

1.2.5.2 重复性试验

精密称取同批次样品（S1），按照1.2.3项的制备方法制备供试品溶液6份，再以1.2.3项所得条件进样测定。

1.2.5.3 稳定性试验

取同一样品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h时按照1.2.3项所得条件进样测定。

1.2.5.4 加样回收率试验

精密称取同一批样品（S1），平行六份，分别以1:1加入各目标成分对照品，按照1.2.2项方法制备供试品溶液，再按照1.2.3项所得条件进样测定，计算加样回收率和RSD。

1.3 数据处理

实验数据运用Excel2019、SPSS25.0和SPSSAU软件进行PCA与TOPSIS法分析，图片数据用Origin 2021软件绘制。

2. 结果与分析

2.1 线性关系考察、检测限和定量限

精密量取1.2.1项配制的对照品溶液各1 μL，按照1.2.3项下优化后的条件参数测定，测得31种目标成分的MRM色谱图见图1。以峰面积积分值Y为纵坐标，其相应的对照品的质量浓度X（μg/mL）为横坐标，作出回归方程，并计算决定系数（R²）和线性范围。分别计算信噪比（S/N）约为3和10时各成分的检测限（LOD）与定量限（LOQ）。表3数据显示31种目标成分在0~144.58 μg/mL范围内线性关系良好，且决定系数R²均大于0.999，方法的检测限与定量限分别在0.15~6.87 ng/mL、0.57~22.76 ng/mL范围内。

图 1 31种标准品的MRM图

Figure 1. MRM diagrams of 31 standard components

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表 3 21种氨基酸和10种核苷的线性关系考察

Table 3. Linear relationship of 21 amino acids and 10 nucleosides

化合物	回归方程	线性范围（μg/mL）	R²	LOD（ng/mL）	LOQ（ng/mL）
甘氨酸	Y=3×10⁶X+147.2	0.034~5.68	0.9992	6.8	22.76
丙氨酸	Y=5×10⁶X−10⁶	0.15~61.43	0.9994	3.03	11.04
丝氨酸	Y=4×10⁸X−4250.3	0.11~10.28	0.9991	0.82	3.26
天门冬氨酸	Y=2×10⁸X+12493	0.024~38.29	0.9991	2.74	9.63
天门冬酰胺	Y=6×10⁸X−2×10⁵	0.13~89.45	0.9996	4.09	13.88
缬氨酸	Y=4×10⁶X−48932	0.097~14.53	0.9993	1.68	5.47
谷氨酸	Y=3×10⁸X+28292	0.19~144.58	0.9991	0.15	0.65
异亮氨酸	Y=2×10⁷X−192213	0.093~10.02	0.9992	4.2	13.74
甲硫氨酸	Y=5×10⁷X−273.7	0.027~1.805	0.9997	3.25	10.75
精氨酸	Y=3×10⁶X−1×10⁵	0.31~59.34	0.9998	3.47	12.31
组氨酸	Y=82104X−29.7	0.40~6.86	0.9995	0.76	2.39
苏氨酸	Y=8×10⁸X+10682.9	0.32~10.59	0.9996	2.11	7.03
苯丙氨酸	Y=4×10⁸X−4564.6	0.068~2.83	0.9998	4.45	14.61
亮氨酸	Y=1×10⁶X−614.9	0.51~34.30	0.9990	6.87	19.54
胱氨酸	Y=32921X−342.4	0.75~13.23	0.9992	0.16	0.57
羟脯氨酸	Y=4×10⁷X−28312.4	0.29~7.41	0.9997	0.23	0.72
酪氨酸	Y=6×10⁷X−72791	0.092~4.24	0.9994	2.49	8.63
色氨酸	Y=4×10⁷X−1×10⁶	0.058~3.92	0.9999	5.68	16.82
脯氨酸	Y=8×10⁷X−34258.3	0.11~3.08	0.9992	2.6	8.97
赖氨酸	Y=74453X−435.6	0.015~10.12	0.9991	3.64	12.06
γ-氨基丁酸	Y=2×10⁸X−432350	0.062~3.66	0.9997	1.74	6.08
鸟嘌呤	Y=4×10⁸X+2123.9	0.032~3.14	0.9998	3.91	12.97
腺嘌呤	Y=5×10⁸X−234321	0.026~2.98	0.9992	1.68	5.78
尿嘧啶	Y=1×10⁹X−33241	0.067~4.02	0.9995	3.32	10.42
次黄嘌呤	Y=1×10⁹X−9283.7	0.031~3.29	0.9991	2.41	8.73
胸苷	Y=7×10⁷X−3124.9	0.056~3.92	0.9991	5.75	18.14
鸟苷	Y=8×10⁷X−15467	0.23~5.82	0.9993	6.1	18.56
肌苷	Y=1×10⁷X−146520	0.14~4.12	0.9996	4.72	16.07
尿苷	Y=4×10⁷X+129202	0.096~4.43	0.9992	4.14	15.83
腺苷	Y=5×10⁶X−146342	0.029~3.87	0.9998	3.31	10.75
胞苷	Y=4×10⁹X+547650	0.024~8.46	0.9996	4.52	14.84

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2.2 精密度、重复性、稳定性及加样回收率

为验证实验的可靠性，对仪器的精密度、重复性、稳定性以及加样回收率进行进样测定，结果显示31种成分日间与日内精密度RSD在0.28%~1.40%，表明仪器精密度良好；重复性RSD在0.98%~2.60%，表明重复性良好；稳定性RSD在0.93%~2.9%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好；平均回收率在92.69%~99.50%，回收率RSD在1.3%~2.9%。详细数据见表4。

表 4 天麻中31种测定成分的精密度、重复性、稳定性及加样回收率（n=6，%）

Table 4. Precision, repeatability, stability and sample recovery of 31 components in Gastrodia elata (n=6, %)

化合物	精密度RSD		重复性 RSD	稳定性 RSD	平均回收率	回收率 RSD
化合物	日间	日内	重复性 RSD	稳定性 RSD	平均回收率	回收率 RSD
甘氨酸	1.25	0.34	1.6	1.7	98.47	1.8
丙氨酸	0.86	0.52	2.1	1.8	97.25	1.7
丝氨酸	0.76	0.73	1.3	1.6	96.38	2.0
天门冬氨酸	0.95	1.0	1.8	2.1	98.12	2.6
天门冬酰胺	0.76	0.82	2.3	1.9	97.75	1.9
缬氨酸	0.35	0.29	1.6	2.1	96.51	2.4
谷氨酸	0.71	0.67	1.5	2.4	98.68	2.1
异亮氨酸	0.93	1.1	1.9	1.7	97.37	2.0
甲硫氨酸	1.38	1.4	2.4	2.9	95.54	1.8
精氨酸	0.87	0.72	2.6	2.5	98.38	2.3
组氨酸	0.92	0.91	2.0	1.1	95.69	2.2
苏氨酸	0.47	0.35	1.9	2.1	97.43	2.4
苯丙氨酸	1.0	0.92	1.7	1.9	96.89	2.8
亮氨酸	0.77	0.74	1.4	1.6	95.01	1.6
胱氨酸	0.48	0.39	2.3	1.2	99.50	2.7
羟脯氨酸	0.72	0.62	2.1	1.6	94.86	2.1
酪氨酸	0.57	0.69	1.7	1.1	95.33	1.9
色氨酸	0.46	0.44	2.2	1.9	97.37	2.9
脯氨酸	0.38	0.41	1.5	1.7	98.13	2.4
赖氨酸	0.31	0.28	1.4	2.1	95.34	1.3
γ-氨基丁酸	0.64	0.76	1.5	2.4	96.08	2.1
鸟嘌呤	0.86	1.2	1.2	0.93	97.21	2.6
腺嘌呤	1.12	0.91	1.9	1.2	98.48	2.9
尿嘧啶	0.92	0.87	2.3	2.0	92.69	2.8
次黄嘌呤	0.64	0.79	1.9	1.2	98.23	2.6
胸苷	0.67	0.71	1.8	1.8	99.02	2.3
鸟苷	0.93	0.82	2.0	1.4	93.31	1.4
肌苷	0.69	0.57	1.7	2.1	95.47	1.5
尿苷	0.41	0.32	0.98	2.9	96.81	2.7
腺苷	0.37	0.48	1.8	1.7	96.42	2.5
胞苷	0.64	0.56	1.4	2.4	97.40	2.6

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2.3 样品测定

按照1.2.2项方法将天麻样品制备供试品溶液，按照1.2.3项所得条件进样测定，每份样品平行测定3次，得到每种指标性成分峰面积，并根据已建立的标准曲线，计算出不同品种天麻中31种目标成分的含量。

由实验数据可知，各批次天麻均存在测定的31种化学成分。氨基酸成分中9批天麻氨基酸总量在7549.43~9816.83 μg·g⁻¹，总量由高到低依次为：S1>S2>S3>S9>S4>S7>S8>S5>S6，不同品种天麻的氨基酸总量差异较大（P<0.05）。其中谷氨酸、天门冬氨酸两种氨基酸含量最高，分别占氨基酸总量的13.5%~16.5%和12.0%~14.5%，这与涂雪莲等^[8]研究结果相似。9批天麻中谷氨酸含量无显著差异（P>0.05），但天门冬氨酸含量上S1（金寨杂交天麻）与S4~S6（金寨红天麻）、S8~S9（云南小草坝乌天麻）呈显著差异（P<0.05）。

此外，9批天麻样品均测出8种人体必需氨基酸，数据表明9批天麻中必需氨基酸的相对含量总量为25.3%~28.8%，其中亮氨酸为主要的必需氨基酸，占总量的30.8%~39.7%。以必需氨基酸总量为评价指标，由高到低依次为：S1>S2>S3>S5>S4>S9>S8>S6>S7，金寨杂交天麻均排在前列，且与其它品种天麻呈显著差异（P<0.05），其中S1金寨班竹园含量达到2533.93±95.46 μg·g⁻¹最高，S2金寨汤家汇含量2436.25±73.39 μg·g⁻¹次之，S3金寨双河镇含量2386.66±83.03 μg·g⁻¹最低，同地区同种天麻必需氨基酸总量未见显著差异（P>0.05）。

核苷成分中9批天麻核苷总量在376.49~746.67 μg·g⁻¹，核苷总量由高到低依次为：S1>S2>S8>S9>S5>S7>S3>S4>S6，不同品种天麻的核苷总量差异较大（P<0.05）。其中腺苷、鸟苷两种核苷含量最高，分别占核苷总量的17.7%~35.1%和9.3%~25.9%，这与肖远灿等^[9]研究结果相似。9批天麻中腺苷含量无显著差异（P>0.05），但鸟苷含量上不同品种天麻呈显著差异（P<0.05）。详细结果见表5。

表 5 不同品种天麻中21种氨基酸和10种核苷的含量测定结果（

$\bar x$ ±s，μg/g，n=3）

Table 5. Contents of 21 amino acids and 10 nucleosides in Gastrodia elata of different varieties (

$\bar x$ ±s, μg/g, n=3)

No.	红乌天麻			红天麻			乌天麻
No.	S1	S2	S3	S4	S5	S6	S7	S8	S9
甘氨酸	790.62±38.24^a	790.12±27.24^a	786.69±31.41^a	592.64±21.48^c	585.13±22.95^c	523.82±17.38^d	559.03±24.16^cd	611.55±27.47^c	683.15±28.58^b
丙氨酸	733.34±26.52^a	669.02±35.12^b	709.33±37.15^ab	386.05±27.67^ef	349.83±12.77^f	414.84±10.56^e	530.33±27.17^cd	502.53±28.67^d	564.23±12.76^c
丝氨酸	81.81±1.35^b	74.93±2.22^bc	110.86±7.34^a	62.97±4.74^cd	52.99±4.96^d	66.35±5.93^c	75.49±2.36^bc	55.37±6.74^cd	71.71±7.62^bc
天门冬氨酸	1181.16±49.42^a	1091.34±41.56^ab	1084.25±37.54^ab	1024.61±36.06^b	1036.74±42.77^b	1006.24±46.36^b	1124.83±54.56^ab	1012.54±27.74^b	1045.71±48.46^b
天门冬酰胺	19.13±0.27^c	30.18±0.51^bc	31.26±1.74^bc	24.01±1.52^c	32.07±1.04^b	28.97±1.54^bc	24.54±0.17^c	88.87±7.73^a	30.13±1.77^bc
缬氨酸	585.76±36.64^a	511.72±29.22^b	578.56±28.33^a	562.86±41.86^ab	369.33±14.16^c	427.55±26.43^c	430.81±36.62^c	408.12±19.47^c	496.54±32.87^b
谷氨酸	1357.44±78.28^a	1304.14±77.39^a	1218.85±69.59^a	1267.18±84.96^a	1183.00±65.77^a	1245.37±92.43^a	1196.75±79.26^a	1252.34±103.21^a	1161.75±87.329^a
异亮氨酸^*	410.93±43.48^ab	459.28±39.26^ab	380.36±31.49^bc	288.73±24.78^c	367.16±41.79^c	291.09±17.84^c	286.38±36.35^c	376.28±32.85^bc	472.78±51.85^a
甲硫氨酸^*	327.84±14.56^a	347.04±9.66^a	148.46±10.74^c	200.87±18.94^b	209.06±12.52^b	94.48±8.74^d	188.56±20.57^b	138.32±15.44^c	87.52±4.76^d
精氨酸^*	481.59±39.54^c	542.41±16.66^bc	682.42±33.73^a	667.66±28.23^a	593.56±32.83^b	650.46±33.32^a	518.91±21.56^c	556.12±28.36^bc	583.54±30.36^bc
组氨酸	263.42±11.31^a	252.90±9.25^ab	244.64±11.21^ab	169.61±11.66^e	194.71±9.93^d	190.35±8.52^de	236.43±12.76^b	181.13±8.85^de	214.93±10.45^c
苏氨酸^*	483.24±39.45^a	265.81±29.63^c	357.21±32.77^b	170.92±15.71^d	207.86±19.62^d	180.26±10.43^d	166.03±9.44^d	165.71±14.89^d	178.21±16.63^d
苯丙氨酸^*	37.72±1.82^a	26.56±0.94^b	24.82±1.76^b	17.97±1.01^c	16.84±0.72^c	15.13±1.89^c	14.03±2.74^c	16.25±1.92^c	10.88±0.86^d
亮氨酸^*	780.69±19.31^a	783.5±21.54^a	782.43±32.86^a	782.27±65.21^a	794.57±24.74^a	776.03±53.9^a	780.19±32.6^a	778.2±35.2^a	790.2±22.1^a
胱氨酸	1102.35±42.71^a	1052.11±76.2^ab	998.41±64.76^abc	933.15±24.96^bc	950.11±51.66^bc	897.63±64.96^c	793.22±63.96^c	859.31±54.43^c	1088.16±46.81^a
羟脯氨酸	505.74±18.53^a	443.75±27.86^b	411.13±22.51^bc	393.43±12.96^bc	335.73±16.68^cd	376.13±13.96^c	442.11±27.63^b	313.67±42.36^d	483.72±28.33^ab
酪氨酸	50.96±2.41^b	29.84±4.52^c	22.66±1.63^cd	30.78±2.56^c	17.62±1.33^d	27.48±3.76^cd	24.45±3.41^cd	71.02±10.43^a	23.46±1.69^cd
色氨酸^*	8.18±0.21^a	7.67±0.12^b	4.43±0.28^e	5.74±0.02^d	6.62±0.11^c	6.58±0.25^c	4.37±0.36^e	4.16±0.24^e	8.02±0.33^ab
脯氨酸	534.23±28.26^a	403.13±16.75^b	385.61±18.87^b	376.92±9.45^b	309.65±8.57^cd	286.14±13.77^d	328.46±12.82^c	290.44±15.34^d	269.96±20.48^d
赖氨酸^*	3.74±0.09^c	3.98±0.13^c	6.53±0.52^a	3.63±0.08^c	2.84±0.16^d	3.49±0.08^c	5.2±0.06^b	4.91±0.25^b	5.1±0.22^b
γ-氨基丁酸	77.25±7.63^b	95.30±5.78^a	32.08±4.64^ef	44.41±5.89^d	26.73±1.13^f	41.34±2.52^de	40.9±3.65^de	81.2±4.28^b	53.81±7.32c
鸟嘌呤	7.34±0.53^a	8.07±0.35^a	5.61±0.52^c	3.32±0.06^e	4.61±0.38^d	2.37±0.08^f	2.06±0.07^f	0.55±0.03^g	3.07±0.24^e
腺嘌呤	5.11±0.42^a	7.65±0.62^a	3.67±0.21^b	3.54±0.05^b	0.88±0.04^d	2.75±0.12^c	3.09±0.25^b	1.12±0.09^d	2.61±0.21^c
尿嘧啶	172.41±15.3^a	11.83±0.82^f	35.31±2.91^e	90.97±4.12^bc	79.45±8.34^c	21.04±1.41^f	89.02±4.85^bc	97.15±4.23^b	54.00±1.90^d
次黄嘌呤	53.73±3.24^bc	42.74±2.49^c	61.61±7.42^b	40.66±4.95^c	34.81±1.77^c	31.61±8.53^c	56.68±4.85^b	38.11±2.98^c	117.1±12.6^a
胸苷	18.64±2.52^ab	20.82±1.95^a	6.31±0.53^d	8.82±1.06^cd	16.77±2.74^b	8.12±0.72^cd	8.15±0.93^cd	5.06±0.12^d	10.92±1.05^c
鸟苷	142.26±4.73^b	179.86±12.64^a	94.19±10.82^c	42.54±0.84^e	130.08±7.84^b	39.55±2.74^e	57.47±4.95^d	132.38±10.6^b	87.46±9.21^c
肌苷	95.91±3.49^a	90.01±2.31^a	72.36±4.62^b	77.41±3.27^b	71.69±5.28^b	74.08±7.32^b	74.35±4.12^b	89.49±5.22^a	75.93±2.51^b
尿苷	113.12±6.56^c	193.44±11.86^a	55.09±6.57^e	54.72±4.56^e	59.39±6.96^e	59.24±7.24^e	74.27±4.91^e	161.5±13.5^b	96.39±7.22^d
腺苷	131.97±7.49^a	132.24±12.63^a	131.91±9.25^a	132.07±10.98^a	132.12±6.33^a	132.78±9.98^a	131.28±8.36^a	132.07±11.3^a	131.98±16.52^a
胞苷	6.34±0.24^b	7.47±0.23^a	5.76±0.38^b	4.16±0.13^c	4.61±0.11^c	5.78±0.18^b	6.46±0.72^b	4.21±0.21^c	4.02±0.15^c
氨基酸总量	9816.83±210.56^a	9108.51±254.68^b	9000.67±195.36^b	8005.34±206.95^cd	7641.36±276.29^d	7549.43±158.35^d	7771.55±269.63^cd	7767.61±384.51^cd	8322.87±295.57^c
核苷总量	746.67±21.56^a	693.97±29.26^b	471.81±17.67^e	458.07±29.34^e	534.31±27.94^d	376.49±16.63^f	503.33±19.26^de	661.76±26.26^b	583.33±18.43^c
必需氨基酸总量	2533.93±95.46^a	2436.25±73.39^a	2386.66±83.03^a	2137.79±63.20^bc	2198.51±72.13^b	2017.52±83.48^bc	1963.67±62.15^c	2039.95±92.09^bc	2136.25±69.25^bc
注：不同字母标注表示同一行数据具有显著性差异（P<0.05）；“*”标记表示人体必需氨基酸。

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利用Excel2019软件分别对不同品种天麻氨基酸与核苷成分进行方差分析。氨基酸方面，红乌天麻与红天麻呈极显著差异（P<0.01），与乌天麻呈显著差异（P<0.05）（详见图2）；核苷方面，红乌天麻与红天麻呈显著差异（P<0.05），与乌天麻未见显著差异（P>0.05）（详见图3）。从氨基酸、核苷含量高低来评价不同品种天麻，金寨红乌天麻要优于亲代乌天麻、红天麻的质量，这可能与不同品种天麻的地理分布（云南与金寨），生长环境（海拔、光照、降水量等）以及栽培方式（大棚栽培、林下仿野生栽培）等因素有关。因此，对于金寨杂交天麻品质研究还需要多指标、多因素综合分析，从单一成分并不能客观评价天麻品质的优劣。

图 2 不同品种天麻总氨基酸比较

注：不同字母标注表示呈显著性差异（P<0.05），图3同。

Figure 2. Comparison of total amino acids of different Gastrodia elata varieties

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图 3 不同品种天麻总核苷比较

Figure 3. Comparison of total nucleosides in different Gastrodia elata varieties

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2.4 主成分分析及综合评价

2.4.1 氨基酸类主成分分析

采用SPSS25.0软件先对原始数据进行无量纲化标准化后，再进行主成分分析。以特征值>1，方差贡献率>5%为筛选标准，系统提取了5个PCs。前5个主成分F1、F2、F3、F4、F5特征值分别为9.850、3.481、2.875、2.120、1.088，方差贡献率为46.905%、16.574%、13.690%、10.094%、5.180%。根据5个组成分及各方差贡献率权重得出各地区天麻的综合评分F值，F=0.46905F₁+0.16574F₂+0.1369F₃+0.10094F₄+0.0518F₅，见表6，结果说明从氨基酸方面评价样品中的天麻品质，S1>S2>S3>S9>S8>S7>S4>S5>S6，S1安徽金寨班竹园红乌天麻评价最高，S6金寨沙河乡红天麻评价最低，总体评价结果呈现乌红天麻>乌天麻>红天麻的差异趋势。

表 6 氨基酸主成分分析及综合评价

Table 6. Principal component analysis and comprehensive evaluation of amino acids

样品	主成分					F	排名
样品	F1	F2	F3	F4	F5	F	排名
S1	6.68	−0.38	−1.65	−0.48	0.09	2.80	1
S2	2.90	0.78	−0.44	0.94	−0.39	1.50	2
S3	1.35	−1.07	3.63	−1.06	0.29	0.86	3
S4	−1.53	−1.40	−0.64	−0.82	1.72	−1.03	7
S5	−2.74	−1.41	−1.67	1.82	0.04	−1.56	8
S6	−2.88	−1.33	−0.70	−1.36	−0.17	−1.81	9
S7	−1.26	−0.77	0.41	−0.18	−2.26	−0.80	6
S8	−1.99	4.22	−0.59	−1.45	0.08	−0.46	5
S9	−0.53	1.36	1.64	2.60	0.59	0.49	4

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2.4.2 核苷类主成分分析

按照2.4.1项下的数据分析方法，SPSS软件提取了2个PCs。主成分F1与F2的特征值分别为4.673、1.368；方差贡献率分别为46.727%、13.676%。根据2个主成分及各方差贡献率权重计算各地区天麻的综合评分F值，F=0.46727F₁+0.13676F₂，见表7，结果说明，从核苷方面评价天麻品质，S2>S1>S3>S5>S7>S9>S4>S6>S8，S2安徽金寨汤家汇红乌天麻评价最高，S8云南昭通小草坝乌天麻品质评价最低，总体评价结果较氨基酸结果变化不大，乌红天麻评价依然高于其它两个品种天麻。

表 7 核苷主成分分析及综合评价

Table 7. Principal component analysis and comprehensive evaluation of nucleosides

样品	主成分		F	排名
样品	F1	F2	F	排名
S1	2.53	−0.41	1.13	2
S2	3.38	0.77	1.68	1
S3	−0.42	0.83	−0.08	3
S4	−0.68	−1.16	−0.48	7
S5	0.35	−1.92	−0.10	4
S6	−0.95	−0.54	−0.52	8
S7	−1.29	1.08	−0.46	5
S8	−1.44	−0.36	−0.72	9
S9	−1.48	1.69	−0.46	6

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2.4.3 基于TOPSIS法综合评价

以核苷和氨基酸含量为指标，采用TOPSIS法对3个天麻品种的31个成分进行综合评价和分析，得出比较排序结果。将S1~S9样品中的21种氨基酸及10种核苷等成分含量的初始化决策数据矩阵进行归一化处理，建立相应矩阵，计算Z值。

${\mathrm{Z}}_{\mathrm{i}\mathrm{j}}={\mathrm{x}}_{\mathrm{i}\mathrm{j}}/\sqrt{\sum _{\mathrm{i}=1}^{\mathrm{n}}{\mathrm{x}}_{\mathrm{i}\mathrm{j}}^{2}}$

(1)

式中：X_ij表示第i个评价对象在第j个指标上的测量值；Z_ij表示第i个评价对象在第j个指标上归一化处理后的取值。

确定最优方案和最劣方案，最优方案Z⁺表示评价指标的最大值,最劣方案Z⁻表示评价指标的最小值。最优方案、最劣方案是计算正负距离（D⁺和D⁻）时的中间过程值。根据下列公式计算相对贴近度（C_i），得到的C_i值可以作为评价天麻综合品质的指标。

${\mathrm{D}}_{\mathrm{i}}^+=\sqrt{\sum _{\mathrm{j}=1}^{\mathrm{m}}{\mathrm{w}}_{\mathrm{j}}{\left({\mathrm{Z}}_{\mathrm{j}}^+-{\mathrm{Z}}_{\mathrm{i}\mathrm{j}}\right)}^{2}}$

(2)

${\mathrm{D}}_{\mathrm{i}}^-=\sqrt{\sum _{\mathrm{j}=1}^{\mathrm{m}}{\mathrm{w}}_{\mathrm{j}}{\left({\mathrm{Z}}_{\mathrm{j}}^--{\mathrm{Z}}_{\mathrm{i}\mathrm{j}}\right)}^{2}}$

(3)

${\mathrm{C}}_{\mathrm{i}}={\mathrm{D}}_{\mathrm{i}}^-/({\mathrm{D}}_{\mathrm{i}}^-+{\mathrm{D}}_{\mathrm{i}}^+)$

(4)

式中：D_i⁺表示各个评价对象与最优方案的距离；D_i⁻表示各个评价对象与最劣方案的距离；w_j为第j个属性的权重（重要程度）。

当C_i（0≤C_i≤1）越接近1时，表明样品的综合品质越高，将各评价对象C_i值大小进行排序。样品中21种氨基酸、10种核苷类TOPSIS分析结果见表8。结果表明，以总成分为分析指标，S1>S2>S8>S3>S9>S4>S5>S7>S6，其中S1安徽金寨班竹园红乌天麻综合评价最高，S6安徽金寨沙河乡红天麻综合评价最低。该方法评价结果与主成分评价结果一致，乌红天麻排序结果皆在前列。结合主成分分析和TOPSIS法分析结果综合来看，金寨杂交天麻营养价值较其亲代品种天麻更高，更适合作为食品资源进一步开发利用。

表 8 样品中31种成分TOPSIS分析结果

Table 8. TOPSIS analysis results of 31 components in the samples

项	总成分			排序结果
项	正理想解距离D⁺	负理想解距离D⁻	相对贴近度C_i	排序结果
S1	0.916	1.789	0.661	1
S2	1.305	1.433	0.523	2
S3	1.634	0.897	0.355	4
S4	1.690	0.700	0.293	6
S5	1.784	0.693	0.28	7
S6	1.923	0.366	0.16	9
S7	1.864	0.499	0.211	8
S8	1.731	1.049	0.377	3
S9	1.703	0.894	0.344	5

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3. 结论

本实验首次通过超高效液相色谱-三重四级杆/线性离子阱质谱技术测定杂交天麻与亲本品种红、乌天麻中31种生物活性成分的含量，包括21种氨基酸和10种核苷，考察了不同品种天麻其内在质量差异并进行了方法学考察，证明该技术适用于天麻中氨基酸以及核苷类成分的分析评价，为其资源的合理利用提供思路以及科学依据。实验结果表明，天麻中含有丰富的氨基酸与核苷类成分，9批天麻的氨基酸总量7549.43~9816.83 μg·g⁻¹，核苷总量376.49~746.67 μg·g⁻¹，均以S1金寨班竹园杂交天麻含量最高，S6金寨沙河乡红天麻含量最低。3种天麻中谷氨酸含量最高，天门冬氨酸含量次之，二者占氨基酸总量的13.5%~16.5%和12.0%~14.5%；核苷类成分中腺苷最高，鸟苷次之，二者占核苷总量的17.7%~35.1%和9.3%~25.9%。杂交品种与亲本品种氨基酸总量、核苷总量差异显著（P<0.05）。各批次天麻样品均存在8种必需氨基酸，其中S1金寨班竹园杂交天麻含量最高达到2533.93±95.46 μg·g⁻¹，S7云南小草坝乌天麻含量最低1963.67±62.15 μg·g⁻¹，二者相差570.26 μg·g⁻¹。亮氨酸为天麻中主要的必需氨基酸，含量达到776.03~794.57 μg·g⁻¹，占必需氨基酸总量的30.8%~39.7%。主成分分析法分别从氨基酸成分和核苷成分两个角度对3种天麻的进行质量评价，评价结果一致，均以S1、S2、S3金寨杂交天麻为优；TOPSIS法以氨基酸、核苷含量为指标，综合评价3种天麻，结果与主成分方法相似，S1、S2金寨杂交天麻排列在前，优于其亲本品种。

不同品种间的质量差异初步推测与天麻的生长环境、栽培方式等外界因素有关，林下栽培天麻质量优于大棚栽培天麻，高海拔天麻质量优于低海拔天麻。曾勇等^[30]在研究不同海拔两种天麻仿野生栽培模式下的质量差异中提出天麻对高海拔具有良好的适应性，低海拔的高温低湿会影响天麻的生长。因此，杂交技术对金寨天麻质量提升效果显著，后续可对杂交后代反复自交以得到稳定遗传性状，便于推广；氨基酸、核苷作为食品中主要营养指标，可衡量食用天麻的品质优劣，金寨杂交天麻后续可朝天麻食品或者保健品产业方向发展。但实验仅从氨基酸以及核苷类营养成分比较天麻质量差异较为片面，后续研究将多方面综合评价杂交天麻与其亲本的品质。

图 1 31种标准品的MRM图

Figure 1. MRM diagrams of 31 standard components

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图 2 不同品种天麻总氨基酸比较

注：不同字母标注表示呈显著性差异（P<0.05），图3同。

Figure 2. Comparison of total amino acids of different Gastrodia elata varieties

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图 3 不同品种天麻总核苷比较

Figure 3. Comparison of total nucleosides in different Gastrodia elata varieties

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表 1 天麻样品采集信息

Table 1 Collection information of Gastrodia elata samples

样品编号	采集地点	品种	海拔（m）	栽培方式
S1	安徽金寨班竹园	红乌天麻	581.2	林下
S2	安徽金寨汤家汇	红乌天麻	593.7	林下
S3	安徽金寨双河镇	红乌天麻	554.9	大棚
S4	安徽金寨果子园	红天麻	348.7	大棚
S5	安徽金寨吴家店	红天麻	366.0	大棚
S6	安徽金寨沙河乡	红天麻	273.1	大棚
S7	云南昭通小草坝	乌天麻	1934.2	大棚
S8	云南昭通小草坝	乌天麻	1883.7	大棚
S9	云南昭通小草坝	乌天麻	1745.4	大棚

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表 2 31种成分测定中优化的质谱条件参数

Table 2 Optimized MS parameters for the determination of 31 components

化合物	保留时间（min）	母离子	子离子	去簇电压（V）	碰撞电压（V）
甘氨酸	5.83	76.04	30.00^*、49.00	73	6
丙氨酸	6.36	90.06	44.02^*、46.78	79	10
丝氨酸	6.18	106.05	59.99^*、74.30	67	8
天门冬氨酸	6.51	134.05	87.96^*、73.80	59	10
天门冬酰胺	4.12	132.80	115.70^*、73.90	46	13
缬氨酸	6.41	118.09	72.06^*、55.06	67	8
谷氨酸	3.46	147.08	83.92^*、130.58	83	14
异亮氨酸	2.98	132.00	86.00^*、69.00	66	15
甲硫氨酸	7.01	150.06	104.03^*、133.00	91	10
精氨酸	6.88	175.12	70.20^*、116.00	88	18
组氨酸	3.52	156.08	110.03^*、93.17	95	16
苏氨酸	3.54	120.30	76.80^*、104.70	54	11
苯丙氨酸	3.55	166.10	120.05^*、103.00	56	14
亮氨酸	6.92	132.10	86.05^*、42.30	98	10
胱氨酸	3.65	240.80	151.90^*、120.00	71	18
羟脯氨酸	4.43	133.80	71.80^*、69.60	52	25
酪氨酸	3.56	182.16	136.08^*、165.10	46	17
色氨酸	5.31	205.00	188.00^*、72.2	202	15
脯氨酸	7.01	116.07	70.02^*、68.03	68	10
赖氨酸	4.29	147.00	84.00^*、130.00	52	24
γ-氨基丁酸	5.68	103.70	86.90^*、87.00	32	14
鸟嘌呤	4.20	151.80	135.00^*、135.00	62	24
腺嘌呤	6.57	136.06	119.00^*、92.00	51	24
尿嘧啶	1.78	113.04	70.00^*、95.00	111	21
次黄嘌呤	6.96	137.05	110.00^*、118.70	46	15
胸苷	5.68	243.10	127.07^*、99.00	61	13
鸟苷	4.21	284.30	152.00^*、135.00	62	15
肌苷	3.34	269.00	137.05^*、137.05	46	15
尿苷	4.21	244.90	113.00^*、70.05	103	13
腺苷	3.47	267.9	118.70^*、135.00	86	23
胞苷	1.54	244.09	94.65^*、111.80	61	10
注：表中“*”标注离子为定量离子。

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表 3 21种氨基酸和10种核苷的线性关系考察

Table 3 Linear relationship of 21 amino acids and 10 nucleosides

化合物	回归方程	线性范围（μg/mL）	R²	LOD（ng/mL）	LOQ（ng/mL）
甘氨酸	Y=3×10⁶X+147.2	0.034~5.68	0.9992	6.8	22.76
丙氨酸	Y=5×10⁶X−10⁶	0.15~61.43	0.9994	3.03	11.04
丝氨酸	Y=4×10⁸X−4250.3	0.11~10.28	0.9991	0.82	3.26
天门冬氨酸	Y=2×10⁸X+12493	0.024~38.29	0.9991	2.74	9.63
天门冬酰胺	Y=6×10⁸X−2×10⁵	0.13~89.45	0.9996	4.09	13.88
缬氨酸	Y=4×10⁶X−48932	0.097~14.53	0.9993	1.68	5.47
谷氨酸	Y=3×10⁸X+28292	0.19~144.58	0.9991	0.15	0.65
异亮氨酸	Y=2×10⁷X−192213	0.093~10.02	0.9992	4.2	13.74
甲硫氨酸	Y=5×10⁷X−273.7	0.027~1.805	0.9997	3.25	10.75
精氨酸	Y=3×10⁶X−1×10⁵	0.31~59.34	0.9998	3.47	12.31
组氨酸	Y=82104X−29.7	0.40~6.86	0.9995	0.76	2.39
苏氨酸	Y=8×10⁸X+10682.9	0.32~10.59	0.9996	2.11	7.03
苯丙氨酸	Y=4×10⁸X−4564.6	0.068~2.83	0.9998	4.45	14.61
亮氨酸	Y=1×10⁶X−614.9	0.51~34.30	0.9990	6.87	19.54
胱氨酸	Y=32921X−342.4	0.75~13.23	0.9992	0.16	0.57
羟脯氨酸	Y=4×10⁷X−28312.4	0.29~7.41	0.9997	0.23	0.72
酪氨酸	Y=6×10⁷X−72791	0.092~4.24	0.9994	2.49	8.63
色氨酸	Y=4×10⁷X−1×10⁶	0.058~3.92	0.9999	5.68	16.82
脯氨酸	Y=8×10⁷X−34258.3	0.11~3.08	0.9992	2.6	8.97
赖氨酸	Y=74453X−435.6	0.015~10.12	0.9991	3.64	12.06
γ-氨基丁酸	Y=2×10⁸X−432350	0.062~3.66	0.9997	1.74	6.08
鸟嘌呤	Y=4×10⁸X+2123.9	0.032~3.14	0.9998	3.91	12.97
腺嘌呤	Y=5×10⁸X−234321	0.026~2.98	0.9992	1.68	5.78
尿嘧啶	Y=1×10⁹X−33241	0.067~4.02	0.9995	3.32	10.42
次黄嘌呤	Y=1×10⁹X−9283.7	0.031~3.29	0.9991	2.41	8.73
胸苷	Y=7×10⁷X−3124.9	0.056~3.92	0.9991	5.75	18.14
鸟苷	Y=8×10⁷X−15467	0.23~5.82	0.9993	6.1	18.56
肌苷	Y=1×10⁷X−146520	0.14~4.12	0.9996	4.72	16.07
尿苷	Y=4×10⁷X+129202	0.096~4.43	0.9992	4.14	15.83
腺苷	Y=5×10⁶X−146342	0.029~3.87	0.9998	3.31	10.75
胞苷	Y=4×10⁹X+547650	0.024~8.46	0.9996	4.52	14.84

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表 4 天麻中31种测定成分的精密度、重复性、稳定性及加样回收率（n=6，%）

Table 4 Precision, repeatability, stability and sample recovery of 31 components in Gastrodia elata (n=6, %)

化合物	精密度RSD		重复性 RSD	稳定性 RSD	平均回收率	回收率 RSD
化合物	日间	日内	重复性 RSD	稳定性 RSD	平均回收率	回收率 RSD
甘氨酸	1.25	0.34	1.6	1.7	98.47	1.8
丙氨酸	0.86	0.52	2.1	1.8	97.25	1.7
丝氨酸	0.76	0.73	1.3	1.6	96.38	2.0
天门冬氨酸	0.95	1.0	1.8	2.1	98.12	2.6
天门冬酰胺	0.76	0.82	2.3	1.9	97.75	1.9
缬氨酸	0.35	0.29	1.6	2.1	96.51	2.4
谷氨酸	0.71	0.67	1.5	2.4	98.68	2.1
异亮氨酸	0.93	1.1	1.9	1.7	97.37	2.0
甲硫氨酸	1.38	1.4	2.4	2.9	95.54	1.8
精氨酸	0.87	0.72	2.6	2.5	98.38	2.3
组氨酸	0.92	0.91	2.0	1.1	95.69	2.2
苏氨酸	0.47	0.35	1.9	2.1	97.43	2.4
苯丙氨酸	1.0	0.92	1.7	1.9	96.89	2.8
亮氨酸	0.77	0.74	1.4	1.6	95.01	1.6
胱氨酸	0.48	0.39	2.3	1.2	99.50	2.7
羟脯氨酸	0.72	0.62	2.1	1.6	94.86	2.1
酪氨酸	0.57	0.69	1.7	1.1	95.33	1.9
色氨酸	0.46	0.44	2.2	1.9	97.37	2.9
脯氨酸	0.38	0.41	1.5	1.7	98.13	2.4
赖氨酸	0.31	0.28	1.4	2.1	95.34	1.3
γ-氨基丁酸	0.64	0.76	1.5	2.4	96.08	2.1
鸟嘌呤	0.86	1.2	1.2	0.93	97.21	2.6
腺嘌呤	1.12	0.91	1.9	1.2	98.48	2.9
尿嘧啶	0.92	0.87	2.3	2.0	92.69	2.8
次黄嘌呤	0.64	0.79	1.9	1.2	98.23	2.6
胸苷	0.67	0.71	1.8	1.8	99.02	2.3
鸟苷	0.93	0.82	2.0	1.4	93.31	1.4
肌苷	0.69	0.57	1.7	2.1	95.47	1.5
尿苷	0.41	0.32	0.98	2.9	96.81	2.7
腺苷	0.37	0.48	1.8	1.7	96.42	2.5
胞苷	0.64	0.56	1.4	2.4	97.40	2.6

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表 5 不同品种天麻中21种氨基酸和10种核苷的含量测定结果（ $\bar x$ ±s，μg/g，n=3）

Table 5 Contents of 21 amino acids and 10 nucleosides in Gastrodia elata of different varieties ( $\bar x$ ±s, μg/g, n=3)

No.	红乌天麻			红天麻			乌天麻
No.	S1	S2	S3	S4	S5	S6	S7	S8	S9
甘氨酸	790.62±38.24^a	790.12±27.24^a	786.69±31.41^a	592.64±21.48^c	585.13±22.95^c	523.82±17.38^d	559.03±24.16^cd	611.55±27.47^c	683.15±28.58^b
丙氨酸	733.34±26.52^a	669.02±35.12^b	709.33±37.15^ab	386.05±27.67^ef	349.83±12.77^f	414.84±10.56^e	530.33±27.17^cd	502.53±28.67^d	564.23±12.76^c
丝氨酸	81.81±1.35^b	74.93±2.22^bc	110.86±7.34^a	62.97±4.74^cd	52.99±4.96^d	66.35±5.93^c	75.49±2.36^bc	55.37±6.74^cd	71.71±7.62^bc
天门冬氨酸	1181.16±49.42^a	1091.34±41.56^ab	1084.25±37.54^ab	1024.61±36.06^b	1036.74±42.77^b	1006.24±46.36^b	1124.83±54.56^ab	1012.54±27.74^b	1045.71±48.46^b
天门冬酰胺	19.13±0.27^c	30.18±0.51^bc	31.26±1.74^bc	24.01±1.52^c	32.07±1.04^b	28.97±1.54^bc	24.54±0.17^c	88.87±7.73^a	30.13±1.77^bc
缬氨酸	585.76±36.64^a	511.72±29.22^b	578.56±28.33^a	562.86±41.86^ab	369.33±14.16^c	427.55±26.43^c	430.81±36.62^c	408.12±19.47^c	496.54±32.87^b
谷氨酸	1357.44±78.28^a	1304.14±77.39^a	1218.85±69.59^a	1267.18±84.96^a	1183.00±65.77^a	1245.37±92.43^a	1196.75±79.26^a	1252.34±103.21^a	1161.75±87.329^a
异亮氨酸^*	410.93±43.48^ab	459.28±39.26^ab	380.36±31.49^bc	288.73±24.78^c	367.16±41.79^c	291.09±17.84^c	286.38±36.35^c	376.28±32.85^bc	472.78±51.85^a
甲硫氨酸^*	327.84±14.56^a	347.04±9.66^a	148.46±10.74^c	200.87±18.94^b	209.06±12.52^b	94.48±8.74^d	188.56±20.57^b	138.32±15.44^c	87.52±4.76^d
精氨酸^*	481.59±39.54^c	542.41±16.66^bc	682.42±33.73^a	667.66±28.23^a	593.56±32.83^b	650.46±33.32^a	518.91±21.56^c	556.12±28.36^bc	583.54±30.36^bc
组氨酸	263.42±11.31^a	252.90±9.25^ab	244.64±11.21^ab	169.61±11.66^e	194.71±9.93^d	190.35±8.52^de	236.43±12.76^b	181.13±8.85^de	214.93±10.45^c
苏氨酸^*	483.24±39.45^a	265.81±29.63^c	357.21±32.77^b	170.92±15.71^d	207.86±19.62^d	180.26±10.43^d	166.03±9.44^d	165.71±14.89^d	178.21±16.63^d
苯丙氨酸^*	37.72±1.82^a	26.56±0.94^b	24.82±1.76^b	17.97±1.01^c	16.84±0.72^c	15.13±1.89^c	14.03±2.74^c	16.25±1.92^c	10.88±0.86^d
亮氨酸^*	780.69±19.31^a	783.5±21.54^a	782.43±32.86^a	782.27±65.21^a	794.57±24.74^a	776.03±53.9^a	780.19±32.6^a	778.2±35.2^a	790.2±22.1^a
胱氨酸	1102.35±42.71^a	1052.11±76.2^ab	998.41±64.76^abc	933.15±24.96^bc	950.11±51.66^bc	897.63±64.96^c	793.22±63.96^c	859.31±54.43^c	1088.16±46.81^a
羟脯氨酸	505.74±18.53^a	443.75±27.86^b	411.13±22.51^bc	393.43±12.96^bc	335.73±16.68^cd	376.13±13.96^c	442.11±27.63^b	313.67±42.36^d	483.72±28.33^ab
酪氨酸	50.96±2.41^b	29.84±4.52^c	22.66±1.63^cd	30.78±2.56^c	17.62±1.33^d	27.48±3.76^cd	24.45±3.41^cd	71.02±10.43^a	23.46±1.69^cd
色氨酸^*	8.18±0.21^a	7.67±0.12^b	4.43±0.28^e	5.74±0.02^d	6.62±0.11^c	6.58±0.25^c	4.37±0.36^e	4.16±0.24^e	8.02±0.33^ab
脯氨酸	534.23±28.26^a	403.13±16.75^b	385.61±18.87^b	376.92±9.45^b	309.65±8.57^cd	286.14±13.77^d	328.46±12.82^c	290.44±15.34^d	269.96±20.48^d
赖氨酸^*	3.74±0.09^c	3.98±0.13^c	6.53±0.52^a	3.63±0.08^c	2.84±0.16^d	3.49±0.08^c	5.2±0.06^b	4.91±0.25^b	5.1±0.22^b
γ-氨基丁酸	77.25±7.63^b	95.30±5.78^a	32.08±4.64^ef	44.41±5.89^d	26.73±1.13^f	41.34±2.52^de	40.9±3.65^de	81.2±4.28^b	53.81±7.32c
鸟嘌呤	7.34±0.53^a	8.07±0.35^a	5.61±0.52^c	3.32±0.06^e	4.61±0.38^d	2.37±0.08^f	2.06±0.07^f	0.55±0.03^g	3.07±0.24^e
腺嘌呤	5.11±0.42^a	7.65±0.62^a	3.67±0.21^b	3.54±0.05^b	0.88±0.04^d	2.75±0.12^c	3.09±0.25^b	1.12±0.09^d	2.61±0.21^c
尿嘧啶	172.41±15.3^a	11.83±0.82^f	35.31±2.91^e	90.97±4.12^bc	79.45±8.34^c	21.04±1.41^f	89.02±4.85^bc	97.15±4.23^b	54.00±1.90^d
次黄嘌呤	53.73±3.24^bc	42.74±2.49^c	61.61±7.42^b	40.66±4.95^c	34.81±1.77^c	31.61±8.53^c	56.68±4.85^b	38.11±2.98^c	117.1±12.6^a
胸苷	18.64±2.52^ab	20.82±1.95^a	6.31±0.53^d	8.82±1.06^cd	16.77±2.74^b	8.12±0.72^cd	8.15±0.93^cd	5.06±0.12^d	10.92±1.05^c
鸟苷	142.26±4.73^b	179.86±12.64^a	94.19±10.82^c	42.54±0.84^e	130.08±7.84^b	39.55±2.74^e	57.47±4.95^d	132.38±10.6^b	87.46±9.21^c
肌苷	95.91±3.49^a	90.01±2.31^a	72.36±4.62^b	77.41±3.27^b	71.69±5.28^b	74.08±7.32^b	74.35±4.12^b	89.49±5.22^a	75.93±2.51^b
尿苷	113.12±6.56^c	193.44±11.86^a	55.09±6.57^e	54.72±4.56^e	59.39±6.96^e	59.24±7.24^e	74.27±4.91^e	161.5±13.5^b	96.39±7.22^d
腺苷	131.97±7.49^a	132.24±12.63^a	131.91±9.25^a	132.07±10.98^a	132.12±6.33^a	132.78±9.98^a	131.28±8.36^a	132.07±11.3^a	131.98±16.52^a
胞苷	6.34±0.24^b	7.47±0.23^a	5.76±0.38^b	4.16±0.13^c	4.61±0.11^c	5.78±0.18^b	6.46±0.72^b	4.21±0.21^c	4.02±0.15^c
氨基酸总量	9816.83±210.56^a	9108.51±254.68^b	9000.67±195.36^b	8005.34±206.95^cd	7641.36±276.29^d	7549.43±158.35^d	7771.55±269.63^cd	7767.61±384.51^cd	8322.87±295.57^c
核苷总量	746.67±21.56^a	693.97±29.26^b	471.81±17.67^e	458.07±29.34^e	534.31±27.94^d	376.49±16.63^f	503.33±19.26^de	661.76±26.26^b	583.33±18.43^c
必需氨基酸总量	2533.93±95.46^a	2436.25±73.39^a	2386.66±83.03^a	2137.79±63.20^bc	2198.51±72.13^b	2017.52±83.48^bc	1963.67±62.15^c	2039.95±92.09^bc	2136.25±69.25^bc
注：不同字母标注表示同一行数据具有显著性差异（P<0.05）；“*”标记表示人体必需氨基酸。

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表 6 氨基酸主成分分析及综合评价

Table 6 Principal component analysis and comprehensive evaluation of amino acids

样品	主成分					F	排名
样品	F1	F2	F3	F4	F5	F	排名
S1	6.68	−0.38	−1.65	−0.48	0.09	2.80	1
S2	2.90	0.78	−0.44	0.94	−0.39	1.50	2
S3	1.35	−1.07	3.63	−1.06	0.29	0.86	3
S4	−1.53	−1.40	−0.64	−0.82	1.72	−1.03	7
S5	−2.74	−1.41	−1.67	1.82	0.04	−1.56	8
S6	−2.88	−1.33	−0.70	−1.36	−0.17	−1.81	9
S7	−1.26	−0.77	0.41	−0.18	−2.26	−0.80	6
S8	−1.99	4.22	−0.59	−1.45	0.08	−0.46	5
S9	−0.53	1.36	1.64	2.60	0.59	0.49	4

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表 7 核苷主成分分析及综合评价

Table 7 Principal component analysis and comprehensive evaluation of nucleosides

样品	主成分		F	排名
样品	F1	F2	F	排名
S1	2.53	−0.41	1.13	2
S2	3.38	0.77	1.68	1
S3	−0.42	0.83	−0.08	3
S4	−0.68	−1.16	−0.48	7
S5	0.35	−1.92	−0.10	4
S6	−0.95	−0.54	−0.52	8
S7	−1.29	1.08	−0.46	5
S8	−1.44	−0.36	−0.72	9
S9	−1.48	1.69	−0.46	6

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表 8 样品中31种成分TOPSIS分析结果

Table 8 TOPSIS analysis results of 31 components in the samples

项	总成分			排序结果
项	正理想解距离D⁺	负理想解距离D⁻	相对贴近度C_i	排序结果
S1	0.916	1.789	0.661	1
S2	1.305	1.433	0.523	2
S3	1.634	0.897	0.355	4
S4	1.690	0.700	0.293	6
S5	1.784	0.693	0.28	7
S6	1.923	0.366	0.16	9
S7	1.864	0.499	0.211	8
S8	1.731	1.049	0.377	3
S9	1.703	0.894	0.344	5

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施引文献

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图(3) / 表(8)

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1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 标准品溶液制备
1.2.2 样品的前处理
1.2.3 测定条件
1.2.3.1 色谱条件
1.2.3.2 质谱条件
1.2.4 定性定量方法
1.2.5 方法学考察
1.2.5.1 精密度试验
1.2.5.2 重复性试验
1.2.5.3 稳定性试验
1.2.5.4 加样回收率试验
1.3 数据处理
2. 结果与分析
2.1 线性关系考察、检测限和定量限
2.2 精密度、重复性、稳定性及加样回收率
2.3 样品测定
2.4 主成分分析及综合评价
2.4.1 氨基酸类主成分分析
2.4.2 核苷类主成分分析
2.4.3 基于TOPSIS法综合评价
3. 结论

1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.2 实验方法
1.2.1 标准品溶液制备
1.2.2 样品的前处理
1.2.3 测定条件
1.2.3.1 色谱条件
1.2.3.2 质谱条件
1.2.4 定性定量方法
1.2.5 方法学考察
1.2.5.1 精密度试验
1.2.5.2 重复性试验
1.2.5.3 稳定性试验
1.2.5.4 加样回收率试验
1.3 数据处理
2. 结果与分析
2.1 线性关系考察、检测限和定量限
2.2 精密度、重复性、稳定性及加样回收率
2.3 样品测定
2.4 主成分分析及综合评价
2.4.1 氨基酸类主成分分析
2.4.2 核苷类主成分分析
2.4.3 基于TOPSIS法综合评价
3. 结论

参考文献(30)

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液相色谱-串联质谱法检测药食两用杂交天麻及其亲本品种中的氨基酸、核苷类成分

作者简介: 王广政（1998−），男，硕士研究生，研究方向：中药资源与中药质量，E-mail：2054332851@qq.com

通讯作者: 俞年军（1965−），男，硕士，教授，研究方向：中药质量评价，E-mail：ynj2005288@sina.com

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