Effect of Asynchronous Fermentation on Quality of Mixed Plant Protein
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摘要: 以豆粕、菜粕和豌豆为混合原料，通过异步发酵工艺改善其蛋白品质。考察不同发酵菌株、原料配比、发酵和酶解条件等单因素条件，并结合响应面试验和正交试验确定最佳的异步发酵工艺，以粗蛋白、酸溶蛋白、蛋白溶解度和蛋白酶活力等指标评价混合蛋白品质。结果表明，单因素实验中米曲霉为最佳的发酵菌株，其分泌的中性蛋白酶活达到676.56 U/g，固态发酵时间为49 h，发酵温度29.9℃，初始发酵水分39.7%。在此工艺下，混合植物原料中的粗蛋白、酸溶蛋白和蛋白溶解度分别提高了15.5%、344%和132%；液态酶解最佳条件为：料水比1:4（m/m），酶解时间18 h，酶解温度50 ℃，酶解后混合植物蛋白的粗蛋白、酸溶蛋白和蛋白溶解度分别提高了2%、101%、244%。综上，优化先固态发酵，后利用发酵产的蛋白酶液态酶解的异步工艺后混合蛋白原料中的粗蛋白、酸溶蛋白和蛋白溶解度明显提高，蛋白质品显著改善，为蛋白的开发利用提供了基础。Abstract: In this study, soybean meal, rapeseed meal and pea were used as mixed raw materials to improve their protein quality by asynchronous fermentation process. Single factor conditions such as different fermentation strains, raw material ratio, fermentation and enzymatic hydrolysis conditions were investigated, and the best asynchronous fermentation process was determined by response surface test and orthogonal test. The quality of mixed protein was evaluated by crude protein, acid-soluble protein, protein solubility and protease activity. The results showed that Aspergillus oryzae was the best fermentation strain in a single-factor experiment, the activity of neutral protease was reached 676.56 U/g, the solid-state fermentation time was 49 h, the fermentation temperature was 29.9 ℃, and the initial moisture was 39.7%. Under this condition, the crude protein, acid-soluble protein and protein solubility in mixed plant raw materials were increased by 15.5%, 344% and 132%, respectively. The optimum conditions of liquid enzymatic hydrolysis were as follows: The ratio of solid to water was 1:4 (m/m), the time of enzymatic hydrolysis was 18 h, and the temperature of enzymatic hydrolysis was 50 ℃. After enzymatic hydrolysis, the crude protein, acid-soluble protein and protein solubility of mixed plant protein were enhanced by 2%, 101% and 244%, respectively. The results showed that after optimizing the asynchronous process of solid-state fermentation and then liquid enzymatic hydrolysis by fermented protease, the crude protein, acid-soluble protein and protein solubility in the mixed protein raw materials were obviously improved, and the protein products were significantly improved, which would provide a basis for the development and utilization of protein.
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豆粕是大豆提油后的副产物，具有蛋白质含量高的优点[1]，在食品应用中功能性豆粕的研究是当前的一个热点[2]。菜粕中粗蛋白含量约为35%~42%，氨基酸含量丰富[3]，其蛋白质具有良好的凝胶特性、成膜特性及一定的生物活[4-5]。豌豆粗蛋白质（250~260 g/kg）含量高，氨基酸结构平衡[6]，具有生长周期短、适应性强，营养价值高的优点[7]，在食品中应用广泛[8]。为制得蛋白质含量高，蛋白品质优良的产品，考虑将上述三种植物蛋白原料混合发酵。
在实际生产生活中，可通过不同的指标反应蛋白质的某些理化特性、功能肽等，如用蛋白溶解度评价蛋白质的起泡、凝胶等性质[9]，酸溶蛋白的含量可用来评价小肽的变化情况[10]。而微生物发酵提高粗蛋白的同时产生的蛋白酶可以将原料中大分子蛋白质分解成中小分子多肽[11]，提高酸溶蛋白。此外，研究表明发酵过程中蛋白溶解也能得到显著提高。因此相关学者一直在探究植物蛋白质原料的发酵和蛋白质提取等工艺。张梦媛等[12]、郑婷婷等[13]利用微生物发酵豆粕，有效提高了其粗蛋白、酸溶蛋白和感官品质。李悦等[2]的研究表明添加适量的汽爆豆粕粉可以有效维持和改善小麦面团质构特性。孙林等[14]使用微生物发酵法获得了高肽、高蛋白、低毒的菜籽粕。李颖等[15]以低筋面粉、豌豆蛋白粉为主料等研制豌豆蛋白饼干。潘芬等[16]的研究表明豌豆蛋白酶解产物可显著促进益生菌的生长，提高其存活率，缩短生产时间。
尽管对植物蛋白已经进行了较多的研究，但目前为止，我国对豌豆深加工主要是豌豆淀粉的提取利用，而对豌豆蛋白的研究大多集中在蛋白提取方法上，发酵豌豆的研究较少[17]，而菜粕和豆粕被大量应用于饲料行业，食品行业对其蛋白质的利用不足，且几乎没有这三种原料混合使用和异步发酵的研究。本研究以微生物发酵法对这三种高蛋白的原料进行异步发酵，通过优化异步发酵工艺达到改善原料蛋白质品质的目的，扩大蛋白原料的利用范围。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
豆粕、菜粕、豌豆、麸皮 由乐山恒峰华邦生物科技有限公司提供；米曲霉TW（Aspergillus oryzae）、黑曲霉41258（Aspergillus niger）、酿酒酵母ATCC 9763（Saccharomyces cerevisiae）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢杆菌23417（Bacillus subtilis）、两歧双歧杆菌10395（Bifidobacterium bifidum） 均为实验室保藏；硼酸（分析纯） 福晨化学品有限公司；硫酸铜（分析纯）、硫酸（分析纯）、硫酸钾（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、干酪素（化学纯） 成都市科隆化学品有限公司；酵母膏、酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖 北京奥博星生物技术有限责任公司。
SPX-260B生化培养箱 杭州绿博仪器有限公司；SPH-1102立式双层摇床 上海世单实验设备有限公司；K9840半自动凯氏定氮仪、SH220F石墨消解仪 山东海能科学仪器有限公司；LS-75HD立式压力蒸汽灭菌锅 江阴滨江医疗设备有限公司；AT-710自动电位滴定仪 日本KEM公司；B-290喷雾干燥机 来亨科技（北京）有限有限公司；烘箱 上海和羽良电子科技有限公司；DFT-200实验室小型粉碎机 温岭市林大机械有限公司；MB25水分分析仪 奥豪斯仪器（上海）有限公司；新世纪T6紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。
1.2 实验方法
1.2.1 混合蛋白产品发酵工艺
豆粕、菜粕、豌豆→混匀调整水分→灭菌→接种发酵→加水磨浆→液态酶解→喷雾干燥→成品
按质量比90:5:5的比例取豆粕、豌豆、菜粕混合均匀，调整初始发酵水分后经固态发酵和液态酶解异步工艺处理混合蛋白原料，最后喷雾干燥得到发酵蛋白质成品。
1.2.2 菌种活化
米曲霉和黑曲霉：以马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L配制马铃薯葡萄糖液体培养基100 mL灭菌冷却后在无菌操作台中用接种针从试管中勾取一环接种，摇床30 ℃、160 r/min培养72 h。酿酒酵母：以酵母膏1%、葡萄糖2%、蛋白胨2%的比例配制液体培养基100 mL灭菌冷却后在无菌操作台中用接种针从试管中勾取一环接种，摇床30 ℃、160 r/min培养24 h。地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌：按上述接种操作接种至MRS培养基内，在恒温培养箱内37 ℃静置培养24 h。两歧双歧杆菌：以营养肉汤5 g/L、酵母粉3 g/L、葡萄糖5 g/L、淀粉1 g/L、乙酸钠3 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L配制液体培养基100 mL，在无菌操作台中用接种针从试管中勾取一环接种，在恒温培养箱内37 ℃静置培养24 h。
1.2.3 麸皮种子制作
菌种活化完成后，麸皮和自来水以质量比2:1的比例混合后取30 g装入500 mL三角瓶，灭菌冷却后用无菌移液管分别吸取1.2.2活化的菌液2 mL液体加入三角瓶中，并用无菌玻璃棒搅拌使菌液和麸皮混合均匀，在恒温培养箱中培养，各菌株培养条件同1.2.2。
1.2.4 单因素实验
1.2.4.1 发酵菌株选择
先以豆粕:菜粕:豌豆为96:2:2的比例称取原料混合均匀，称取1.0~1.5 g混合后的样品，根据水分分析仪使用说明测定水分，添加适量蒸馏水补充水分至40%，按150 g/瓶分装到2 L三角瓶中，121 ℃灭菌15 min，物料冷却至室温时分别称取1.2.2制作的不同菌株麸皮种子3 g与物料混合均匀，用棉塞封住瓶口，置于恒温培养箱发酵（米曲霉、酿酒和黑曲霉发酵温度为30 ℃，地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和两歧双歧杆菌发酵温度为37 ℃）。以不添加菌株的发酵组为空白组，考察不同菌株发酵对物料粗蛋白、酸溶蛋白、蛋白溶解度和酶活力的影响。
1.2.4.2 米曲霉接种量的选择
分别接种1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%的米曲霉麸皮种子，按1.2.4.1方法发酵，考察米曲霉接种量对混合原料粗蛋白、酸溶蛋白、蛋白溶解度和蛋白酶活的影响。
1.2.4.3 原料配比选择
豆粕、豌豆和菜粕中豆粕蛋白质含量最高，考虑其用量最大，其余两种原料占比较小，三种原料按不同比例混合后进行固态发酵（原料比例见表1），考察不同原料配比对粗蛋白、酸溶蛋白、蛋白溶解度和蛋白酶活力影响。
表 1 豆粕、豌豆、菜粕比例Table 1. Ratio of soybean meal, pea and rapeseed meal分组 A B C D E F G H I J K L 豆粕（%） 90 90 90 92 92 92 94 94 94 96 96 96 豌豆（%） 10 5 0 8 4 0 6 3 0 4 2 0 菜粕（%） 0 5 10 0 4 8 0 3 6 0 2 4 1.2.4.4 发酵时间的选择
控制初始发酵水分为30%，发酵温度30 ℃，发酵时间分别为24、36、48、60、72 h，考察发酵时间对粗蛋白、酸溶蛋白、蛋白溶解度以及蛋白酶活的影响。
1.2.4.5 发酵初始水分的选择
控制发酵时间为48 h，发酵温度30 ℃，根据1.2.2水分控制方法控制初始发酵水分分别为25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%，考察发酵初始水分对粗蛋白、酸溶蛋白、蛋白溶解度以及蛋白酶活的影响。
1.2.4.6 发酵温度的选择
控制初始发酵水分为40%，发酵时间48 h，发酵温度分别为24、26、28、30、32、34和36 ℃，考察发酵温度对粗蛋白、酸溶蛋白、蛋白溶解度以及蛋白酶活的影响。
1.2.4.7 混合蛋白产品发酵条件响应面试验设计
使用Design Expert 12软件进行响应面设计。以发酵时间、发酵温度、初始发酵水分三个考察因素及其变化水平设计三因素三水平响应面方案，试验因素设计如表2。
表 2 响应面试验因素与水平Table 2. Response surface test factors and levels水平 因素 A发酵时间（h） B发酵温度（℃） C发酵初始水分（%） −1 36 28 35 0 48 30 40 1 60 32 45 1.2.5 酶解工艺单因素实验设计
1.2.5.1 液态酶解时间的选择
蛋白原料发酵48 h后立即加入相同质量的无菌水混匀，用榨汁机粉碎后倒入500 mL灭菌三角瓶，瓶口先用保鲜膜盖住，再用封口膜封口以隔绝空气，放入恒温培养箱控制温度为40 ℃，分别酶解12、18、24、30、36、42、48 h，考察酶解时间对粗蛋白、酸溶蛋白和蛋白溶解度的影响。
1.2.5.2 液态酶解温度的选择
物料处理方法同1.2.4.1，恒温培养箱温度分别为40、45、50、55 ℃，酶解24 h后取出测定指标，考察酶解温度对粗蛋白、酸溶蛋白和蛋白溶解度的影响。
1.2.5.3 液态酶解料水比的选择
物料处理方法同1.2.4.1，酶解温度45 ℃，物料和无菌水的质量比分别为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5，酶解24 h后取出测定指标，考察料水比例对粗蛋白、酸溶蛋白和蛋白溶解度的影响。
1.2.5.4 酶解条件正交试验设计
以酶解时间、酶解温度、酶解料水比三个考察因素及其变化水平设计三因素三水平正交试验，试验因素设计如表3。
表 3 正交试验因素与水平Table 3. Orthogonal test factors and levels项目 A温度（℃） B时间（h） C料水比（m:m） 1 40 18 1:2 2 45 24 1:3 3 50 30 1:4 1.2.6 发酵混合植物蛋白干燥
低温干燥：酶解结束后，将液体倒入直径15 cm的培养皿中，在45 ℃烘箱内干燥，间隔每隔12 h测定一次水分，水分含量降低至8%~10%结束干燥并用粉碎机粉碎。
喷雾干燥：设置喷雾干燥条件为进样速度7 mL/min，进口温度设置为110 ℃，出口温度设置为70 ℃。
1.2.7 指标测定
粗蛋白质含量的测定参照李旋等[18]的方法检测，采用三氯乙酸法[19]测定酸溶蛋白含量，蛋白溶解度测定按GB/T 19541-2017《饲料原料豆粕》中蛋白溶解度测定方法进行测定和计算。蛋白酶活测定使用福林法检测[20]，检测过程中通过使用乳酸和乳酸钠调整酪蛋白溶液pH，酸性蛋白酶活和中性蛋白酶活分别调整酪蛋白溶液pH至酸性和中性。
1.3 数据处理
实验过程中所有试验设3次重复，取3次试验平均值表示最终结果。响应面试验的设计与分析使用Design-expert 12.0软件。其他数据的绘图与分析使用Origin 2018、SPSS 26.0软件，t检验法分析组间差异显著性，P<0.05表示有统计学意义。
2. 结果与分析
2.1 发酵菌株选择
2.1.1 不同菌株对发酵混合蛋白的影响
由图1和图2可知，使用芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌发酵组蛋白质含量（P<0.05）降低，酿酒酵母组、两歧双歧杆菌发酵组，粗蛋白约为32.0 g/100 g；米曲霉发酵组、黑曲霉发酵组蛋白质含量显著提高（P<0.05），粗蛋白分别提高到37.87和37.51 g/100 g；酸溶蛋白含量分别提高至14.43%、14.05%，蛋白溶解度分别提高至22.53%、26.00%。在发酵过程中，米曲霉黑曲霉发酵过程中可以大量分泌蛋白酶，起到边发酵边酶解的作用，使蛋白质量提高[21-22]。发酵后粗蛋白增加，可能是添加的发酵微生物生长时产生代谢产物菌体蛋白等，增加原料中的氮含量。测定各发酵组的蛋白酶活力，米曲霉发酵的样品中性蛋白酶活在各发酵组中最高，酶活达到676.56 U/g，不同菌株发酵后原料的pH会有改变，从而影响蛋白酶发挥作用，发酵样品pH在7左右，因而中性蛋白酶活较高。研究结果表明，米曲霉为最佳发酵菌株，发酵过程中可使蛋白原料的粗蛋白、酸溶蛋白和蛋白溶解度得到提高。
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图 2 不同发酵菌株中性蛋白酶活和酸性蛋白酶活差异Figure 2. Differences in neutral protease activity and acid protease activity among different fermentation strains![]()
图 3 米曲霉接种量对粗蛋白、酸溶蛋白、蛋白溶解度的影响Figure 3. Effects of Aspergillus oryzae inoculation amount on crude protein, acid-soluble protein and protein solubility![]()
图 4 米曲霉接种量对蛋白酶活力的影响Figure 4. Effect of Aspergillus oryzae inoculum on protease activity![]()
图 5 不同原料配比对粗蛋白、酸溶蛋白和蛋白溶解度的影响Figure 5. Effects of different proportions of raw materials on crude protein, acid-soluble protein and protein solubility![]()
图 6 不同原料配比对蛋白酶活力的影响Figure 6. Effect of different raw material ratio on protease activity![]()
图 7 不同发酵时间对粗蛋白、酸溶蛋白和蛋白溶解度的影响Figure 7. Effect of different fermentation times on crude protein, acid-soluble protein and protein solubility![]()
图 8 不同发酵时间对蛋白酶活力的影响Figure 8. Effect of different fermentation time on protease activity![]()
图 9 不同发酵初始水分粗蛋白、酸溶蛋白、蛋白溶解度差异Figure 9. Differences of crude protein, acid-soluble protein and protein solubility in different fermentation water![]()
图 10 不同发酵初始水分对蛋白酶活力的影响Figure 10. Effect of different fermentation moisture on protease activity![]()
图 11 发酵温度对粗蛋白、酸溶蛋白、蛋白溶解度的影响Figure 11. Effect of fermentation temperatures on crude protein, acid-soluble protein and protein solubility2.1.2 米曲霉接种量选择
由图3和图4可知，与米曲霉0添加量的空白组相比，添加了米曲霉的发酵组酸溶蛋白含量变化较高。空白组酸溶蛋白含量不到5%，添加米曲霉发酵后显著上升（P<0.05），升高至10%以上。米曲霉发酵混合蛋白原料，粗蛋白含量变化很多不显著（P>0.05），说明米曲霉添加量对粗蛋白的影响不明显，主要受影中性蛋白酶活力、酸溶蛋白和蛋白溶解度。添加米曲霉后，酸溶蛋白和蛋白溶解度显著（P<0.05）升高。添加米曲霉后检测发酵样品的蛋白酶活，中性蛋白酶活始终高于酸性蛋白酶活。米曲霉添加量达到3%时，中性蛋白酶活力显著（P<0.05）高于其他组，最添加量在1%~6%之间，蛋白酶活力均维持在300 U/g以上，继续增加米曲霉添加量，蛋白酶活出现下降趋势。接种量越大，米曲霉消耗原料的营养越多，接种量太小，短时间内，菌体的生产效率较低[23]。不同接种量的米曲霉发酵物料的效果不同，本试验选择米曲霉接种量为3%，可获得最大酶活。
2.2 发酵原料配比选择
由图5和图6可知，三种原料按不同的比例混合发酵，中性蛋白酶活力始终高于酸性蛋白酶活力，且不同的实验组蛋白酶活力差别较大，可以看到不同的原料组合，样品的蛋白质以及发酵过程中的酶活力有明显的变化，B组酸溶蛋白显著高于其他组（P<0.05），为保证蛋白质含量和发酵效果，既要求蛋白质含量高，同时蛋白酶活也要高，虽然E组粗蛋白较高，但其蛋白酶活、酸溶蛋白和蛋白溶解度显著（P<0.05）低于B组。选择B组作为发酵组，粗蛋白、酸溶蛋白和蛋白酶活较高。
2.3 发酵条件单因素实验
2.3.1 发酵时间的选择
由图7和图8可知，发酵前48 h内，粗蛋白含量显著（P<0.05）升高，48 h后其含量化不显著（P>0.05）。蛋白酶活力在48 h显著（P<0.05）高于其他组，继续增加发酵时间酶活力开始下降。36~48 h内，酸溶蛋白含量变化不显著（P>0.05），延长发酵时间至60 h，酸溶蛋白含量显著升高（P<0.05）。结合蛋白酶活力的变化趋势分析，在豆粕发酵过程中，米曲霉通过生长、分泌蛋白酶以及酶解三个阶段发挥作用[24]。发酵初期，米曲霉利用原料中的营养物质不断生长繁殖。发酵时间超过48 h，米曲霉开始分泌氨基酸、多肽等物质，同时胞外蛋白质开始积累[25]，蛋白酶活出现下降趋势。从酸溶蛋白的变化趋势可知，在米曲霉固态发酵混合蛋白原料的过程中，米曲霉产酶和酶解是同步进行的，根据试验结果，选择48 h作为发酵结束时间可控制原料中的蛋白酶活力最高。
2.3.2 发酵初始水分的选择
由图9和图10可知，发酵样品粗蛋白含量随发酵水分的增加逐渐降低（P<0.05），此现象是由水的稀释作用引起的，粗蛋白的变化无法反应出发酵效果，因此本实验主要以酸溶蛋白和蛋白溶解度变化反应定发酵的初始水分。根据实验结果，水分从25%上升到40%，酸溶蛋白和蛋白溶解度显著（P<0.05）升高，水分为40%时，酸溶蛋白含量提高22.58%，蛋白溶解度提高到36.37%，水分继续增加，酸溶蛋白和蛋白溶解度开始降低。米曲霉的生长和代谢都离不开氧气,本实验中，2 L三角瓶仅含150 g物料，剩余的空间可为发酵提供充足的氧气，而水分的多少会对氧气的通入量产生影响，水分含量太低，微生物活动降低，不利于其生长，水分过高，物料会出现板结的情况，对氧气的通入十分不利[26]，从而影响发酵效果。
2.3.3 发酵温度的选择
由图11和图12可知，发酵温度升高，酸溶蛋白和蛋白溶解度含量逐渐增加，温度为30 ℃时，酸溶蛋白含量显著（P<0.05）高于其他组，温度继续升高，酸溶蛋白开始下降。升高温度，粗蛋白含量持续上升。在不同温度下，米曲霉所产生的蛋白酶活力不同，30 ℃时米曲霉蛋白酶活力显著（P<0.05）高于其他温度下的蛋白酶活，米曲霉最适产酶温度为30 ℃。当发酵温度超过30 ℃后，米曲霉的活动受到了温度的限制，生成的蛋白酶量开始减少，蛋白酶活力也在大幅度降低。温度的高低会影响米曲霉的生长，合适的温度下才能更好的生长[27]。根据试验结果，米曲霉的最佳发酵温度30 ℃，此时米曲霉分泌蛋白酶的活性最高。
2.3.4 发酵条件响应面优化
用Design-Expert.12软件对试验结果（表4）进行多元回归方程拟合，获得以酸溶蛋白目标函数的二次回归拟合方程：
表 4 响应面试验设计方案及结果Table 4. Response surface test design scheme and results实验号 A发酵时间（h） B发酵温度（℃） C发酵水分（%） 酸溶蛋白（%） 1 36 28 40 7.99 2 60 28 40 7.80 3 36 32 40 9.17 4 60 32 40 9.50 5 36 30 35 7.87 6 60 30 35 8.25 7 36 30 45 9.42 8 60 30 45 8.67 9 48 28 35 8.78 10 48 32 35 7.69 11 48 28 45 8.56 12 48 32 45 10.73 13 48 30 40 13.47 14 48 30 40 12.05 15 48 30 40 12.47 16 48 30 40 12.15 17 48 30 40 12.12 Y=−439.371+1.431A+22.602B+3.619C+0.005AB−0.004AC+0.0815BC−0.014A2−0.431B2−0.0715C2
由表5可知，用响应面法建立的二次回归模型显著（P<0.01），失拟项不显著（P=0.6998>0.05），说明该回归模型能够很好地对响应值进行预测。一次项B、C、交互项BC、二次项B2以及C2为显著（P<0.05），二次项A2极显著（P<0.01），各因素对发酵混合蛋白原料饲料酸溶蛋白含量的影响强度依次为发酵水分（C）>发酵温度（B）>发酵时间（A）。
表 5 回归模型方差分析Table 5. Variance analysis of regression model来源 平方和 自由度 均方差 F值 P值 显著性 模型 57.85 9 6.43 23.36 0.0002 * A 0.0056 1 0.0056 0.0202 0.8910 B 1.95 1 1.95 7.08 0.0324 * C 2.87 1 2.87 10.43 0.0144 * AB 0.0669 1 0.0669 0.2431 0.6370 AC 0.3159 1 0.3159 1.15 0.3195 BC 2.66 1 2.66 9.67 0.0171 * A² 18.78 1 18.78 68.25 < 0.0001 ** B² 12.53 1 12.53 45.53 0.0003 * C² 13.46 1 13.46 48.92 0.0002 * 误差 1.93 7 0.2752 失拟项 0.5286 3 0.1762 0.5043 0.6998 纯误差 1.40 4 0.3494 1.40 总和 59.78 16 59.78 决定系数：R2=0.9263，调整决定系数：$R_{\rm{Adj}}^2 $=0.8220 注：**表示极显著（P<0.01）；*表示显著（P<0.05）。 2.3.5 响应面分析结果
各因素交互作用对蛋白原料酸溶蛋白含量影响的响应面图如图13所示。
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图 13 各因素交互分析的响应面图Figure 13. Response surface diagram of interaction analysis of various factors经Design-Expert12.软件优化处理，得到发酵混合蛋白的发酵条件为：发酵温度29.9 ℃、发酵时间49 h、发酵水分39.7%。将优化后的发酵工艺参数条件进行3组平行发酵试验以验证实验的可行性，结果显示3个试验组中酸溶蛋白平均值为12.374%，与理论预测值12.469%的相对误差为0.76%，与试验结果相符。
2.4 酶解条件优化
2.4.1 液态酶解时间的选择
由图14可知，延长酶解时间，酶解时间对粗蛋白影响不显著（P>0.05）。0~24 h内，酸溶蛋白含量显著（P<0.05）上升且上升速度较快；30~48 h内，酸溶蛋白含量基本稳定，变化不显著（P>0.05）。开始酶解时，蛋白酶活力较高，酶解效率高，因此酸溶蛋白快速增加，随着酶解过程的持续，酶解速率降低甚至不再发生酶解过程，因而酸溶蛋白含量保持不变。在0~12 h内，样品蛋白溶解度迅速升高到80%以上（P<0.05），随后保持稳定状态，不再有显著变化（P>0.05）。酶解时间太长时，会有酸溶蛋白分解速率加快的现象，且过程中可能有小肽会被分解成氨基酸，因而酸溶蛋白含量呈降低趋势[28]。综合粗蛋白、蛋白溶解度和酸溶蛋白的变化情况，酶解时间选择24 h。
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图 16 酶解过程中料水比对蛋白质的影响Figure 16. Effect of material-water ratio on protein during enzymatic hydrolysis2.4.2 液态酶解温度的选择
由图15可知，不同酶解温度下，粗蛋白质含量各组间变化不显著（P>0.05），酶解对粗蛋白质几乎不产生影响。45 ℃时，酸溶蛋白含量显著高于其他组（P<0.05），酸溶蛋白先上升到最大值63.44%，然后开始下降，达到最大值时酸溶蛋白相比发酵结束时提高了约3倍。当环境温度和pH固定，蛋白酶的活性可以保持一定的水平[29]。温度过低酶活性会降低，温度过高酶活不仅会出现降低的情况，甚至蛋白质结构会被破坏，导致酶活力丧失[30]，通过实验探究可知，45 ℃为最佳酶解温度条件。
2.4.3 液态酶解料水比的选择
由图16可知，发酵物料与水的比例料水比由1:1调整到1:5，物料的粗蛋白含量显著（P<0.05）降低，由16 g/100 g下降到6 g/100 g，是由水的稀释作用引起的，因此粗蛋白不能作为评价酶解效果的指标。不同的料水比例对样品的蛋白溶解度影响不显著（P>0.05）。料水比由1:1到1:3，酸溶蛋白含量由逐渐升高，料水比为1:3时，酸溶蛋白含量显著高（P<0.05）于其他组，达到66.65%，继续增加水的用量，酸溶蛋白开始下降。改变物料和水的比例，实际是改变发酵底物的浓度，底物质量浓度过高，一方面底物在酶分子上聚集导致酶分子无法释放，另一方面水的有效浓度被降低从而导致分子扩散性的降低[31]。增大料水比，底物质量浓度降低，底物含量不变，豆粕与酶的接触的几率减少，蛋白酶不能最大发挥作用[32]。合适的料水比才能够避免诸多因素的影响，提高酶解效率，因此，发酵物料与水的比例1:3时合适。
2.4.4 正交试验优化酶解条件
由单因素实验结果可知，酶解过程中变化比较显著的是酸溶蛋白和蛋白溶解度，由于蛋白溶解度几乎不受料水比的影响，因此选择酸溶蛋白为正交试验优化的考察指标。根据表6可知，酶解温度时间和料水比对发酵样品的酸溶蛋白存在影响，最优组合为A3B3C1，即酶解温度50 ℃、酶解时间30 h、酶解料水比1:2。在此条件下重复三次实验，结果分别为67.88%、67.38%、67.11%，标准偏差为0.47%，低于试验组7，选择试验组7为最佳酶解组，即酶解温度50 ℃、酶解时间18 h、酶解料水比1:4。
表 6 酶解条件正交试验结果Table 6. Results of orthogonal experiment on enzymatic hydrolysis conditions实验号 A B C 酸溶蛋白（%） 1 1 1 1 57.80±0.23c 2 1 2 2 56.70±0.44c 3 1 3 3 53.65±0.21de 4 2 1 2 52.16±0.12e 5 2 2 3 52.95±1.03e 6 2 3 1 63.25±0.14b 7 3 1 3 68.52±0.32a 8 3 2 1 61.14±1.05c 9 3 3 2 65.40±0.31ab k1 56.05 59.49 60.73 k2 56.12 56.93 58.09 k3 65.02 60.77 58.37 A>B>C R 8.97 3.84 2.64 SS 159.68 22.91 12.62 注：表中不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 2.5 干燥方式选择
由表7可知，喷雾干燥所得样品粗蛋白、酸溶蛋白和蛋白溶解度高于低温干燥样品，受温度影响最大的是酸溶蛋白。由图17可知，喷雾干燥样品呈细碎粉末状，颗粒较小，颜色较白，低温干燥所得样品颜色偏黄，并且有黑色颗粒物存在，感官品质不佳。由于低温干燥时间较长，酸溶蛋白含量大大降低，选择喷雾干燥较为合适。
表 7 发酵混合植物蛋白成品粗蛋白、酸溶蛋白和蛋白溶解度Table 7. Fermented mixed plant protein finished crude protein, acid-soluble protein and protein solubility检测指标 喷雾干燥 45 ℃干燥 粗蛋白（g/100 g） 48.20±0.03a 47.80±0.06b 酸溶蛋白（%） 66.76±0.21a 52.24±0.43b 蛋白溶解度（%） 83.61±1.21a 83.25±0.92a 注：同行不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 ![]()
图 17 发酵混合植物蛋白成品干燥状态Figure 17. Fermented mixed vegetable protein finished in dry state3. 结论
豆粕、菜粕、豌豆蛋白质含量丰富，本实验探究了微生物发酵对这三种原料蛋白质的影响。结果表明，以米曲霉为发酵菌株，经异步发酵工艺可显著提高混合原料的蛋白质，混合原料在40%初始水分，45 ℃下发酵48 h，加入4倍质量水50 ℃液态酶解18 h得到液体产品，对产品进行喷雾干燥，粗蛋白达到48.20 g/100 g，酸溶蛋白为66.76%，蛋白溶解度为83.61%，大大改善了原料的蛋白质品质。粗蛋白含量是衡量蛋白质原料是否优良的重要指标，酸溶蛋白的提高可以反映出小肽含量的增加，蛋白溶解度和蛋白质的乳化性等理化特性密切相关，研究为混合蛋白原料的进一步利用提供了一定的思路，但是对于几种蛋白质发酵和酶解产物功能性研究还未涉及，需进一步研究探讨。
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图 2 不同发酵菌株中性蛋白酶活和酸性蛋白酶活差异
Figure 2. Differences in neutral protease activity and acid protease activity among different fermentation strains
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图 3 米曲霉接种量对粗蛋白、酸溶蛋白、蛋白溶解度的影响
Figure 3. Effects of Aspergillus oryzae inoculation amount on crude protein, acid-soluble protein and protein solubility
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图 4 米曲霉接种量对蛋白酶活力的影响
Figure 4. Effect of Aspergillus oryzae inoculum on protease activity
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图 5 不同原料配比对粗蛋白、酸溶蛋白和蛋白溶解度的影响
Figure 5. Effects of different proportions of raw materials on crude protein, acid-soluble protein and protein solubility
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图 6 不同原料配比对蛋白酶活力的影响
Figure 6. Effect of different raw material ratio on protease activity
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图 7 不同发酵时间对粗蛋白、酸溶蛋白和蛋白溶解度的影响
Figure 7. Effect of different fermentation times on crude protein, acid-soluble protein and protein solubility
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图 8 不同发酵时间对蛋白酶活力的影响
Figure 8. Effect of different fermentation time on protease activity
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图 9 不同发酵初始水分粗蛋白、酸溶蛋白、蛋白溶解度差异
Figure 9. Differences of crude protein, acid-soluble protein and protein solubility in different fermentation water
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图 10 不同发酵初始水分对蛋白酶活力的影响
Figure 10. Effect of different fermentation moisture on protease activity
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图 11 发酵温度对粗蛋白、酸溶蛋白、蛋白溶解度的影响
Figure 11. Effect of fermentation temperatures on crude protein, acid-soluble protein and protein solubility
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图 13 各因素交互分析的响应面图
Figure 13. Response surface diagram of interaction analysis of various factors
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图 16 酶解过程中料水比对蛋白质的影响
Figure 16. Effect of material-water ratio on protein during enzymatic hydrolysis
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图 17 发酵混合植物蛋白成品干燥状态
Figure 17. Fermented mixed vegetable protein finished in dry state
表 1 豆粕、豌豆、菜粕比例
Table 1 Ratio of soybean meal, pea and rapeseed meal
分组 A B C D E F G H I J K L 豆粕（%） 90 90 90 92 92 92 94 94 94 96 96 96 豌豆（%） 10 5 0 8 4 0 6 3 0 4 2 0 菜粕（%） 0 5 10 0 4 8 0 3 6 0 2 4 
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表 2 响应面试验因素与水平
Table 2 Response surface test factors and levels
水平 因素 A发酵时间（h） B发酵温度（℃） C发酵初始水分（%） −1 36 28 35 0 48 30 40 1 60 32 45
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表 3 正交试验因素与水平
Table 3 Orthogonal test factors and levels
项目 A温度（℃） B时间（h） C料水比（m:m） 1 40 18 1:2 2 45 24 1:3 3 50 30 1:4
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表 4 响应面试验设计方案及结果
Table 4 Response surface test design scheme and results
实验号 A发酵时间（h） B发酵温度（℃） C发酵水分（%） 酸溶蛋白（%） 1 36 28 40 7.99 2 60 28 40 7.80 3 36 32 40 9.17 4 60 32 40 9.50 5 36 30 35 7.87 6 60 30 35 8.25 7 36 30 45 9.42 8 60 30 45 8.67 9 48 28 35 8.78 10 48 32 35 7.69 11 48 28 45 8.56 12 48 32 45 10.73 13 48 30 40 13.47 14 48 30 40 12.05 15 48 30 40 12.47 16 48 30 40 12.15 17 48 30 40 12.12
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表 5 回归模型方差分析
Table 5 Variance analysis of regression model
来源 平方和 自由度 均方差 F值 P值 显著性 模型 57.85 9 6.43 23.36 0.0002 * A 0.0056 1 0.0056 0.0202 0.8910 B 1.95 1 1.95 7.08 0.0324 * C 2.87 1 2.87 10.43 0.0144 * AB 0.0669 1 0.0669 0.2431 0.6370 AC 0.3159 1 0.3159 1.15 0.3195 BC 2.66 1 2.66 9.67 0.0171 * A² 18.78 1 18.78 68.25 < 0.0001 ** B² 12.53 1 12.53 45.53 0.0003 * C² 13.46 1 13.46 48.92 0.0002 * 误差 1.93 7 0.2752 失拟项 0.5286 3 0.1762 0.5043 0.6998 纯误差 1.40 4 0.3494 1.40 总和 59.78 16 59.78 决定系数：R2=0.9263，调整决定系数：R2Adj=0.8220 注：**表示极显著（P<0.01）；*表示显著（P<0.05）。
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表 6 酶解条件正交试验结果
Table 6 Results of orthogonal experiment on enzymatic hydrolysis conditions
实验号 A B C 酸溶蛋白（%） 1 1 1 1 57.80±0.23c 2 1 2 2 56.70±0.44c 3 1 3 3 53.65±0.21de 4 2 1 2 52.16±0.12e 5 2 2 3 52.95±1.03e 6 2 3 1 63.25±0.14b 7 3 1 3 68.52±0.32a 8 3 2 1 61.14±1.05c 9 3 3 2 65.40±0.31ab k1 56.05 59.49 60.73 k2 56.12 56.93 58.09 k3 65.02 60.77 58.37 A>B>C R 8.97 3.84 2.64 SS 159.68 22.91 12.62 注：表中不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
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表 7 发酵混合植物蛋白成品粗蛋白、酸溶蛋白和蛋白溶解度
Table 7 Fermented mixed plant protein finished crude protein, acid-soluble protein and protein solubility
检测指标 喷雾干燥 45 ℃干燥 粗蛋白（g/100 g） 48.20±0.03a 47.80±0.06b 酸溶蛋白（%） 66.76±0.21a 52.24±0.43b 蛋白溶解度（%） 83.61±1.21a 83.25±0.92a 注：同行不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
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