Research Progress on HMOs Interacting with Intestinal Flora to Regulate Infant Immune Function
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摘要: 人乳低聚糖（human milk oligosaccharides，HMOs）是母乳中的一类重要组分，迄今为止已经确定了200多种结构不同的HMOs。HMOs能在肠道微生物的作用下产生短链脂肪酸，对婴儿健康产生有益影响，这是母乳与配方粉的主要区别之一。研究表明，不同种类的肠道微生物利用不同机制来识别和消化不同结构的HMOs，维持肠道菌群平衡。同时，HMOs还具有缓解过敏症状，预防坏死性小肠结肠炎等多种功能。本文对HMOs的结构、种类与含量、与婴儿肠道菌群的互作及其免疫调节功能进行了综述。HMOs可促进婴儿肠道菌群的定植与生长，并通过多种方式直接或间接调节婴儿免疫功能。本文为HMOs在婴幼儿食品中的应用提供理论支持，对其未来研发方向提供新思路。Abstract: Human milk oligosaccharides (HMOs) are very important components in human milk, and more than 200 different HMOs have been identified so far. HMOs act as prebiotics by the metabolism of gut microbiota to produce short-chain fatty acids, which have a beneficial effect on infant health. This is one of the main differences between breast milk and formula milk powder. Studies have shown that different species of gut microbiota use different mechanisms to recognize and digest HMOs with different structures, maintaining the balance of the gut microbiota. HMOs also have a variety of functions such as relieving allergic symptoms and preventing necrotizing enterocolitis. In this paper, the type, structure and content of HMOs, interaction between HMOs and infant gut microbiota, and their immune regulatory functions are reviewed. HMOs can promote colonization and growth of gut microbiota in infants, and directly or indirectly regulate the infant immune function. This paper provides theoretical support for the application of HMOs in infant foods, and contributes new ideas to the future research and development direction.
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人乳低聚糖（human milk oligosaccharides，HMOs）是母乳特有的活性成分，其含量仅次于乳糖和脂类，结构和功能多样，属于复杂的混合低聚糖。婴儿摄入的HMOs中，有近97%~99%无法被胃酸和消化酶分解，因此大部分HMOs能够到达大肠，可作为益生元与肠道菌群相互作用，产生对婴儿发育至关重要的短链脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFA）和乳酸等代谢产物。此外，HMOs能够作为信号分子，直接与宿主细胞表面的受体作用，在调节婴儿肠道免疫、刺激婴儿免疫系统的发育成熟、缓解过敏症状、治疗早产儿的坏死性小肠结肠炎、治疗腹泻、促进大脑发育等方面具有重要意义。
HMOs种类繁多，结构复杂，体外合成困难。目前，加入配方粉中的HMOs多为在母乳中含量多且结构简单的2'-岩藻糖基乳糖（2'-fucosyllactose，2'-FL），最近部分配方粉中也添加3'-唾液酸乳糖（3'-sialyllactose，3'-SL）和乳酰-N-新四糖（lacto-N-neotetraose，LNnT），同时2'-FL也将作为膳食补充剂应用于成年人食品[1]。许多研究分析不同结构的HMOs与肠道微生物间的作用机制复杂多样，在人体内所发挥的功能有所不同。深入了解每种HMOs的分子作用机制，指导在婴配粉中强化HMOs，使婴配粉的功能更接近母乳，这对婴配粉喂养婴儿的肠道健康至关重要。因此，本文将综述不同种类HMOs被肠道微生物的利用情况及其功能，阐述HMOs与免疫功能的关系，为婴配粉的研发提供新思路。
1. HMOs概述
1.1 HMOs的结构与其在母乳中的含量
HMOs是由3~22个单糖组成的低聚糖，其结构多样，基于质谱分析，迄今已发现并表征了200多种HMOs。HMOs的五个结构单元包括葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡糖胺、岩藻糖和唾液酸[2]。所有HMOs的还原末端都有连接乳糖，并且可以通过不同数量的乳糖-N-二糖（Galβ1,3GlcNAc，1型LacNAc）或N-乙酰乳糖胺（Galβ1,4GlcNAc，2型LacNAc），以β键进行延伸。一些HMOs具有高度复杂的多支链结构，其支链的形成与β1,6-N-乙酰葡糖胺基转移酶密切相关，该转移酶在N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine，GlcNAc）的3位或4位上以β键连接添加半乳糖基，其可以通过1型或2型结构进一步扩展。此酶的重复作用会使HMOs产生高度复杂的多分支结构[3]。
寡糖链的末端通过α1,2-、α1,3-和α1,4-岩藻糖基化以及α2,3-和α2,6-唾液酸化，形成以下三种主要类型的HMOs：中性岩藻糖基化HMOs，约占所有HMOs种类中的35%~50%，包括2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL）、3-岩藻糖基乳糖（3-fucosyllactose，3-FL）等；中性非岩藻糖基化HMOs，约占42%~55%，例如乳酰-N-六糖（lacto-N-hexaose，LNH）、乳糖-N-新四糖（LNnT）等；酸性唾液酸化HMOs，约占12%~14%，包括3'-唾液酸乳糖（3'-SL）、二唾液酸-乳糖-N-四糖（disialyl-lacto-N-tetraose，DSLNT）等。表1列出了一些常见HMOs的核心结构。母乳中，中性HMOs含量占总HMOs的80%以上，远高于唾液酸化HMOs。
中文名称 英文名称 缩写 结构 含量（g/L） 中文名称 英文名称 缩写 结构 含量 g/L 中性岩藻糖基化HMOs 2'-岩藻糖基乳糖 2'-fucosyllactose 2'-FL Fuc-α-1,2-Gal-β-1,4-Glc 0.45~4.04 乳酰-N-岩藻五糖III lacto-N- fucopentaose III LNFP III Gal-β-1,4-（Fuc-α-1,3-）GlcNAc-β-1,3-Gal-β-1,4-Glc 0.05~0.39 3-岩藻糖基乳糖 3-fucosyllactose 3-FL Gal-β-1,4-（Fuc-α-1,3-）Glc 0.07~0.86 乳酰-N-二岩藻糖I lacto-N- difucotetraose I LNDFH I Fuc-α-1,2-Gal-β-1,3-（Fuc-α-1,4-）GlcNAc-β-1,3-Gal-β-1,4-Glc 0.12~1.38 乳酰-N-岩藻五糖I lacto-N-fucopentaose I LNFP I Fuc-α-1,2-Gal-β-1,3-GlcNAc-β-1,3-Gal-β-1,4-Glc 0.52~1.76 二岩藻糖基-乳糖-N-己糖A difucosyl-lacto-N-hexaose a DFLNH a Gal1-4（Fuc1-3）GlcNAc1-6[Gal1-3（Fuc1-4）GlcNAc1-3]Gal1-4Glc 乳酰-N-二岩藻糖II lacto-N-difucotetraose II LNDFH II Gal-β-1,3-（Fuc-α-1,4-）GlcNAc-β-1,3-Gal-β-1,4-（Fuc-α-1,3-）Glc 0.09~0.21 二岩藻糖基-乳糖-N-己糖B difucosyl-lacto-N-hexaose b DFLNH b Gal1-4（Fuc1-3）GlcNAc1-6（Fuc1-2Gal1-3GlcNAc1-3）Gal1-4Glc 0.32~0.63 中性非岩藻糖基化HMOs 乳酰-N-新四糖 lacto-N- neotetraose LNnT Gal-β-1,4-GlcNAc-β-1,3-Gal-β-1,4-Glc 0.10~2.04 乳酰-N-六糖 lacto-N-hexaose LNH Gal-β-1,3-GlcNAc-β-1,3-（Gal-β-1,4-GlcNAc-β-1,6-）Gal-β-1,4-Glc 0.05~0.11 乳酰-N-四糖 lacto-N- tetraose LNT Gal-β-1,3-GlcNAc-β-1,3-Gal-β-1,4-Glc 0.18~1.18 乳酰-N-新六糖 lacto-N-neohexaose LNnH Gal-β-1,4-GlcNAc-β-1,3-（Gal-β-1,4-GlcNAc-β-1,6-）Gal-β-1,4-Glc 0.10~0.18 酸性唾液酸化HMOs 3'-唾液酸乳糖 3'-sialyllactose 3'-SL Sia-α-2,3-Gal-β-1,4-Glc 0.18~0.27 唾液酸-乳糖-N-四糖B sialyl-lacto-N-tetraose b LST b GlcNAc-β-1,3- （Sia-α-2,6-）（Gal-β-1,3-）Gal-β-1,4-Glc 0.10~0.16 6'-唾液酸乳糖 6'-sialyllactose 6'-SL Sia-α-2,6-Gal-β-1,4-Glc 0.38~1.30 唾液酸-乳糖-N-四糖C sialyl-lacto-N-tetraose c LST c Sia-α-2,6-Gal-β-1,4-GlcNAc-β-1,3-Gal-β-1,4-Glc 0.17~0.74 唾液酸-乳糖-N-四糖A sialyl-lacto-N-tetraose a LST a Sia-α-2,3-Gal-β-1,3-GlcNAc-β-1,3-Gal-β-1,4-Glc 0.04~0.14 二唾液酸-乳糖-N-四糖 disialyl-lacto-N-tetraose DSLNT Sia-α-2,6-GlcNAc-β-1,3-（Sia-α-2,3-Gal-β-1,3-）-Gal-β-1,4-Glc 0.49~0.53 研究表明，在母乳中存在的所有HMOs中，2'-FL含量最高，母乳中浓度约为0.45~4.04 g/L；其次是3-FL[4]，含量为0.07~0.86 g/L；LNT的含量为0.18~1.18 g/L；LNnT的含量为0.10~2.04 g/L； LNFP I的含量为0.52~1.76 g/L；LNDFH I的含量为0.12~1.38 g/L[5]。目前大多使用2'-FL和3-FL进行HMOs的体内外功能研究。
1.2 母乳中HMOs的结构与含量的影响因素
不同母亲的母乳HMOs结构和含量存在很大差异，其影响因素有很多，例如母亲自身体质、哺乳期、胎次、孕期状况和环境因素等[9]。首先，源自分泌型与非分泌型母亲的乳样中HMOs种类和浓度差异很大。分泌型母亲的HMOs主要有LNFP I、LNDFH I和2'-FL三种，而非分泌型母亲的乳样中LNFP II、3-FL和LNDFH II三种HMOs的含量占主导。同时，分泌型母亲的母乳中HMOs浓度高于非分泌型，且所有个体HMOs种类及含量因分泌者状态而异[10]。其次，HMOs的浓度在哺乳期内有所变化。Plows等[6]在对西班牙亚裔母婴的一项研究中发现，哺乳过程中大多数HMOs的浓度都显著降低，但2'-FL、LSTb和DSLNT除外，它们的浓度变化与时间无明显关系。3-FL和3'-SL浓度在哺乳期内显著增加。3-FL的浓度，从哺乳期开始1个月到24个月时增加10倍，3'-SL则在同一时间段内增加2倍[6]。哺乳母亲自身状况也会显著影响母乳HMOs含量，例如，胎次与某种HMOs独立相关，经产母亲的HMOs中LNnT和LNT较高，3-FL较低[10]。研究指出，母体孕前体重指数（pre-pregnancy body mass index，PPBMI）会影响HMOs组成。母乳中2'-FL、其他岩藻糖基化HMOs和总HMOs的浓度随着母亲PPBMI的增高而增加[11]。而LNnT的浓度则与PPBMI呈负相关[9]。同时，HMOs的组成也可能会受到分娩后母亲体重的影响，但潜在机制仍不明确[12]。此外，季节地域等环境因素也会影响HMOs的组成与结构，例如Davis等[13]在针对非洲冈比亚的研究中发现，在雨季哺乳的母亲产生的HMOs浓度比在旱季哺乳的母亲低。母亲的饮食结构也会影响HMOs的含量，一项研究发现维生素A摄入量高的母乳中唾液酸化HMOs浓度较高[14]。未来的研究需要充分了解母亲饮食影响HMOs的组成及含量的具体机制。
1.3 HMOs的人工合成方法
对于无法进行母乳喂养的婴儿，为使婴儿获得充足营养，缩小母乳和婴儿配方粉之间组成的差距，需额外补充HMOs，这在一定程度上利于婴儿肠道的健康，然而从天然产物中分离获得的HMOs量很少，无法大规模添加到婴配粉中，因此人工合成HMOs的方法成为最佳的选择[15]。
目前，HMOs的合成方法包括化学法、微生物法、酶法、酶促合成法以及全细胞合成法等[16]，其中应用最广泛的是化学法和酶促合成法。研究人员首先发明了化学合成法。HMOs化学合成的主要挑战是糖基化的立体和区域选择性控制与繁琐的保护基操作，即当化合物上的某一基团反应时，为避免其他基团被影响，反应前先将其他基团加以保护，当反应完成后再恢复。因此保护基操作的难度随低聚糖链长和分支的增加而增大[17]。为解决上述问题，研究人员提出了“一锅法”的HMOs合成方法。其原理是通过调控糖基供体和受体的活性，使得两步或者多步糖基化反应连续进行，从而避免糖基化反应过程中大量的保护基操作和中间体的分离纯化，提高反应效率[15]。其中最典型的是WONG等[18]研发的“程序化一锅法”，它使高反应活性的模块首先被活化。“预活化的一锅合成法”规避了大量的保护基操作，使合成效率大幅度提高[19]。为克服化学合成法的自身局限性，人们开始研究生物合成方法。酶促合成反应因具有良好的立体和区域选择性备受瞩目。酶法合成中常用的两类酶为糖基转移酶和糖苷水解酶。目前，李芸[20]通过酶法采用模块串联，实现了12种岩藻糖基化HMOs的大量合成。Saumonneau等[21]对B. longum-α-1,3/4-L-岩藻糖苷酶进行设计，得到了对产物水解能力低、与受体结合能力增强、转糖苷活性提高的突变酶，该酶以3-FL为糖基供体，以LNT为受体，可合成LNFP II。
1.4 HMOs应用
在部分发达国家，关于HMOs应用的法规逐渐完善。截至目前，欧盟和美国已经分别批准2'-FL、LNnT、LNT、3'-SL、6'-SL和3-FL共6种不同的HMO的单个成分和它们的混合物作为新食品原料和“一般公认安全”（GRAS）物质，使用范围包括婴幼儿配方奶粉以及烘焙食品、乳制品、饮料等普通食品类别，使用量因申报单位不同而要求不一。其中，欧盟法规批准的2017/2470规定2'-FL在婴儿和较大婴儿配方奶粉中的单独用量最高为1.2 g/L，两种6′-SL在婴配粉中添加量最高为0.5 g/L。美国GRAS公告中涉及6′-SL的共计5个在婴配粉中添加量最高为0.5 g/L。
澳大利亚新西兰食品标准局（FSANZ）于2019年7月22日拟批准在婴儿配方食品与其他产品中使用微生物发酵生产的2'-FL或与LNnT混合使用，并规定：如果仅添加2'-FL，2'-FL不超过96 mg/100 kJ；如果添加2'-FL和LNnT，则LNnT不超过24 mg/100 kJ，并且2'-FL和LNnT的总和不超过96 mg/100 kJ。2021年11月8日，FSANZ对通过转基因大肠杆菌菌株发酵生产的2'-FL用于婴儿配方食品、较大婴儿配方食品和幼儿配方补充食品的应用申请发布批准报告，规定其最大添加量不得超过2.4 g/L[16]。
在我国，2021年下半年，卫健委共受理了三款2'-FL作为食品添加剂新品种的申报事项，此三款产品目前均已经在补正资料中。其中合成法来源的产品虽已于2021年10月发布了征求意见稿，但后续再次延期发补，目前处于资料补正阶段。相信随着未来研究的进展和中国相关法规的完善，HMOs在中国将拥有广阔的市场前景。
2. HMOs与婴儿肠道菌群的互作
婴儿体内肠道菌群会在出生后和生命的最初的几个月内迅速定植生长，肠道微生物的组成对宿主的代谢、免疫和神经系统的功能有重大影响。当肠道微生物多样性降低或微生态失调时，会使儿童患上坏死性结肠炎、哮喘、自闭症等疾病。
HMOs对婴儿肠道菌群的定植与平衡产生至关重要的影响。HMOs对胃酸有抵抗力，不被消化酶分解，到达肠道时其结构不会发生任何变化，随后可被一些肠道细菌充当食物来源进行发酵利用，同时产生短链脂肪酸，形成对肠道中部分有益微生物生长繁殖有利的酸性环境[22]。近年来，一些研究团队采用体内和体外试验，基于质谱法分析低聚糖的消耗以及细菌生长动力学等，试图揭示各种存在于婴儿肠道中的微生物，例如两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、拟杆菌等对HMOs的偏好与利用[23−24]。
2.1 岩藻基化HMOs与肠道微生物间的作用机制
2.1.1 双歧杆菌利用岩藻基化HMOs的机制
双歧杆菌利用HMOs的方式包括细胞内消化和胞外降解两种。短双歧杆菌等可通过转运蛋白将HMOs以完整形式运输进细胞内，利用胞内酶降解；两歧双歧杆菌等会在细胞外产生多种糖苷水解酶（glycoside hydrolases，GH），例如1,2-α-L-岩藻糖苷酶、1,3-1,4-α-L-岩藻糖苷酶和唾液酸酶等先部分水解HMOs，再通过转运蛋白将水解产物运输至细胞质进一步降解，从而实现岩藻糖基化和唾液酸化HMOs的有效利用。因此，双歧杆菌菌株能否利用岩藻基化HMOs的决定性因素是菌体中是否含有编码活性岩藻糖苷酶的基因以及ABC转运蛋白[25]。
不同种类的双歧杆菌所能利用的岩藻基化HMOs的种类与具体机制也不同。大多数双歧杆菌都可利用2'-FL，其过程分为两个阶段：首先在胞外经GH作用将其水解，接着利用ABC转运蛋白将2'-FL从胞外转运进入胞内，然后通过各种糖苷水解酶完成对2'-FL的利用[25]，双歧杆菌利用3-FL的机制与利用2′-FL的机制相似[24]。两歧双歧杆菌B. bifidum会在胞外分泌岩藻糖苷酶直接将2'-FL水解[24]。B. longum subsp. infantis ATCC15697则不同于其他双歧杆菌属，它存在于细胞质中，利用FL-转运蛋白-1和FL-转运蛋白-2转运岩藻糖基化HMOs，其中FT-转运蛋白-2可以转运复杂的HMOs，而FT-转运蛋白-1仅能转运短的岩藻糖基化HMOs[26]。例如，B. longum subsp. infantis ATCC15697在LNFP I上生长良好[27]，说明LNFP I可被长双歧杆菌婴儿亚种作为碳源而利用。
2.1.2 拟杆菌、罗氏菌属对岩藻基化HMOs的利用
Kijner等[28]绘制了从婴儿粪便中分离出的拟杆菌属的生长曲线，并对拟杆菌分离株进行RNA测序，证明了拟杆菌属能够利用HMOs。拟杆菌属通常采用“外部降解”策略利用HMOs，该策略与菌体表面相关的碳水化合物结合蛋白和多糖利用位点所含有的能编码分泌性糖苷水解酶的基因密切相关。即拟杆菌中的每一个多糖利用位点都具有识别和捕获不同种类低聚糖的能力，从而使拟杆菌在细胞表面结合HMOs，并通过外膜SusC型孔蛋白将其转运到周质空间中被各种糖苷水解酶降解为更小的寡糖或单糖，随后被运输到细胞质中进一步降解。这种降解机制对不同HMOs的利用能力存在很大差异，例如以粪便拟杆菌B. stercoris为代表的一些菌株不能利用任何HMOs作为单一碳源生长，而其他如普通类杆菌B. vulgatus则在各种低聚糖中表现出生长特点，脆弱拟杆菌B. fragilis对非岩藻糖基化聚糖利用高于岩藻糖基化寡糖[23]，这表明拟杆菌属细菌的代谢多样性。拟杆菌属在补充2'-FL时，表现出显著的生长加速和pH降低，但与大多数双歧杆菌属相比，它们产生的乳酸和短链脂肪酸更少。当补充3-FL时，多数拟杆菌属均表现出明显的α-L-岩藻糖苷酶活性，消耗40%或更多的3-FL，将3-FL转化为SCFAs（乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐），但只有普通拟杆菌ATCC8482产生乳酸，同时pH显著降低[29]。由此可见，拟杆菌属利用人乳低聚糖后产生的代谢产物也不尽相同。
罗氏菌属中的R. inulinivorans表达糖苷水解酶GH136中的两种酶，这两种酶存在于菌体细胞外膜上，并在细胞外水解岩藻糖基化的HMOs（LNFP I、LNDFH I和LNDFH II），然后通过ABC转运蛋白将它们转运到细胞质，实现对HMOs的分解利用。当R. hominis存在时，细胞质中的GH136会将LNT转化为乳糖和LNB[22]。
2.2 非岩藻基化HMOs与肠道微生物间的作用机制
部分双歧杆菌产生的细胞内糖苷水解酶GHs能将唾液酸和岩藻糖从HMOs的核心结构中去除，而未被降解的非岩藻基化HMOs会被其他相应的肠道微生物产生的水解酶分解利用。例如乳糖-N-四糖（LNT）会被B. longum亚种表达乳糖-N-生物苷酶（GH136）分解，也可被B. bifidum产生的酶（GH20）水解为乳糖-N-二糖（LNB）和乳糖。随后这些产物通过LNB转运蛋白运输进细胞质中，由乳-N-二糖磷酸化酶（LNBP、GH112）进一步将它们降解转化为半乳糖-1-磷酸（Gal-1-P）和相应的N-乙酰葡糖胺[22]。双歧杆菌还可利用乳-N-二糖（LNB），Rubio-Del-Campo等[30]发现包括B. bifidum、B. breve和B. longum subsp.在内的所有测试菌株可在体外发酵LNB。可利用LNnT的双歧杆菌较多，B. bifidum对LNnT等复杂的HMOs可进行细胞外水解，B. longum subsp. infantis和B. breve能将一些完整的LNnT导入细胞[31]，其中，B. longum中含有的β-半乳糖苷酶和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶会依次作用而水解乳糖-N-新四糖（LNnT），分别释放出Gal和GlcNAc[32]。β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的同源基因也存在于B. breve UCC2003，因此B. breve UCC2003也可以消化细胞质中的LNnT，但该菌株不能分解利用岩藻糖基化HMOs[33]。此外，研究发现B. dentium Y510和Y521菌株也可利用LNT和LNnT，使环境pH适度降低。
目前研究证明除双歧杆菌外其他菌种对非岩藻糖基化HMOs的利用不明显。肠球菌属、脂溶乳杆菌属、乳杆菌属、乳酸杆菌属、葡萄球菌属和链球菌属的部分测试菌株均不能利用非岩藻基化HMOs生长[34]。
2.3 肠道微生物对唾液酸化HMOs的利用
2.3.1 双歧杆菌对唾液酸化HMOs的利用
HMOs中的唾液酸部分可保护其免受细菌利用。具有α2-3唾液酸酶活性的可利用HMOs的双歧杆菌菌株在没有体外水解牛奶聚糖中的α2-6键的情况下不会发酵唾液酸化乳低聚糖。因此，长双歧杆菌婴儿ATCC15697亚种利用二唾液酸-乳糖-N-四糖（DSLNT）并产生具有活性的高效NanH2 α2-6唾液酸酶对实现唾液酸化HMOs的分解代谢具有重要意义[35]。其他种双歧杆菌可利用的唾液酸化HMOs多为3'-SL和6'-SL两种。Yu等[29]证明，当在培养基中添加一定浓度的3'-SL时，B. longum JCM7007、7009、7010、7011、11347及ATCC15697会诱导神经氨酸酶活性，消化培养基中40%以上的3'-SL，将3'-SL代谢成乳酸和短链脂肪酸，促进细菌的生长。而在培养基中添加6'-SL时，细菌诱导神经氨酸酶的水平更高。不同菌种代谢HMOs所产生的产物也不同，B. longum JCM1272代谢3'-SL仅产生短链脂肪酸。B. longum JCM7009、7010、7011和11347消化6'-SL产生大量乳酸和短链脂肪酸，B. longum JCM7007只能将其代谢为乳酸，但B. longum JCM1260、1272及ATCC15708仅产生SCFA，不产生乳酸。
2.3.2 其他微生物对唾液酸化HMOs的利用
研究发现，可利用3'-SL和6'-SL的微生物较多。多形类杆菌B. thetaiotaomicron ATCC29148能诱导神经氨酸酶活性消耗3'-SL。普通拟杆菌Bacteroides vulgatus可利用3'-SL和6'-SL。脆弱类杆菌Bacteroides fragilis可利用6'-SL进行生长和代谢，但不能利用3'-SL[29,36]。以上菌种均将唾液酸化HMOs代谢为短链脂肪酸。
表皮葡萄球菌可利用唾液酸-乳糖-N-四糖C（LST c）作为碳源生长。Hunt等[37]在含有和不含HMOs的各种培养基中，研究各种HMOs对葡萄球菌生长的影响，实验证明，使用选择性培养基从人母乳中分离的表皮葡萄球菌S. epidermidis的上清液中，LST c的浓度降低，即LST c可在体外刺激表皮葡萄球菌的生长，与在人乳中检测到的结果呈正相关。
罗氏菌属也可利用部分唾液酸化HMOs进行生长代谢。Wang等[38]分别采集产后3个月的母乳喂养和配方粉喂养婴儿的粪便，同时收集母乳样本进行HMOs的提取和纯化。通过细菌16S rRNA基因测序，发现罗氏菌属的丰度与二唾液酸-乳糖-N-四糖（DSLNT）的浓度呈负相关，证明了罗氏菌属对DSLNT的利用。
2.4 肠道微生物间的交叉喂养
各肠道菌群间的代谢存在交叉喂养现象，交叉喂养是指一种细菌所产生的代谢产物可作为其他微生物的底物，从而促进其生长的现象[39]。研究表明，两歧双歧杆菌在总双歧杆菌属的占比超过10%时，婴儿肠道菌群中双歧杆菌的丰度更高[40]，证明两歧双歧杆菌降解HMOs的产物可被不同种类的双歧杆菌利用，促进其他种双歧杆菌的生长。肠球菌，链球菌等本身虽不会降解HMOs，但它们可能会利用部分分解产物或其他肠道细菌（如双歧杆菌和拟杆菌）产生的发酵终产物[38]。通过不同微生物对HMOs分解产物的有效利用可实现肠道菌群的生长与平衡，对人体肠道健康具有重要意义。
2.5 HMOs的浓度与婴儿肠道微生物群的丰度之间的关系
HMOs的浓度会显著影响婴儿肠道菌群的丰富度，促进有益菌的生长。Frese等[41]报告，从第7 d到第28 d对母乳喂养的婴儿连续施加B. infantis EVC001发现婴儿粪便中HMOs浓度降低，同时粪便中菌群丰度增加。研究小组使用B. breve M-16V也报告了类似的观察结果，因此，HMOs的粪便浓度与婴儿粪便中一些双歧杆菌的丰度呈负相关。Shang等[42]收集了中国济宁（n=27）和哈尔滨（n=32）的健康、足月、自然分娩、纯母乳喂养的1月龄婴儿的新鲜粪便样本及同一天的母乳样本进行分析，研究发现，济宁母亲母乳HMOs浓度高于哈尔滨母乳，婴儿肠道双歧杆菌丰度也高于哈尔滨婴儿，其中母乳LNFP I和DSLNT水平与双歧杆菌丰度呈显著正相关（P<0.05），而3-FL和LNFP III水平与双歧杆菌丰度呈现负相关。拟杆菌丰度与3-FL、LNFP II水平呈正相关，乳杆菌丰度与母乳中的3-FL、LDFT和LNDFH II 浓度呈正相关。尽管不同菌种的丰度与HMOs浓度的相关性并不完全一致，但毋庸置疑的是，HMOs的浓度对肠道微生物的组成有显著影响。
2.6 婴儿肠道微生物利用HMOs的作用效果
HMOs作为婴儿身体发育的关键物质，已被证明可促进有益肠道菌群发展，刺激婴儿大脑早期生长[43]。已有临床研究表明，在婴儿配方奶粉中加入2'-FL和LNnT是安全的，对婴儿健康有显著好处，例如使用添加HMOs的婴配粉的婴儿患支气管炎和下呼吸道疾病的较少，且出生后前12个月的抗生素使用率明显下降[44]。这些临床结果与微生物群发育的有益调节有关[45−46]。综上，婴儿肠道微生物可利用HMOs而对自身健康产生有利影响。
3. HMOs对婴儿的免疫调节作用
3.1 HMOs通过调节肠道菌群提供免疫保护
如前文所述，HMOs可在婴儿生命的最初几周塑造肠道微生物群，使一些可利用HMOs的有益菌定植生长。因此，HMOs可通过调节宿主的肠道微生物组成，降低各种病原微生物对各种细胞受体的结合亲和力，从而提高肠道免疫功能。某些拟杆菌和双歧杆菌可分解HMOs产生乙酸和丁酸，可以降低肠道的pH，抑制致病菌的生长，这些短链脂肪酸对维持肠道健康也有着重要作用。此外，HMOs还可以通过影响细菌粘附素的表达增强益生菌菌株的粘附能力，延长益生菌的肠道转运时间并增加宿主与微生物或微生物与微生物的相互作用，对感染性疾病提供进一步保护[47]。
3.2 HMOs改善肠道屏障
肠道健康和屏障功能是先天免疫的第一道防线，在早期新生儿生命中相当重要。HMOs分解产物短链脂肪酸在免疫细胞的激活和分化，改善肠上皮免疫防御功能方面发挥重要作用，并且与炎症和过敏性疾病有关。例如SCFA可以通过与宿主上皮的相互作用促进肠上皮细胞成熟并刺激粘蛋白释放，而粘蛋白可以构成肠道粘液防止肠道感染[48−49]。Raqib等[50]证明短链脂肪酸中丁酸盐增加了人类大肠上皮细胞的抗菌肽的表达，同时丁酸盐还调节T细胞数量和活性的增加，抑制中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞和效应T细胞的聚集和促炎活性[51]。
HMOs可以改变上皮细胞表面的糖基化模式来支持肠道屏障。Angeloni等[52]使用微阵列聚糖分析表明3'-SL诱导Caco-2细胞系胞外糖基化模式的改变，使Caco-2细胞中肠致病性大肠杆菌减少50%。同时，2'-FL和3-FL的存在显着增加了白蛋白的厚度，而3-FL增加了白蛋白的覆盖面积和Caco-2细胞糖萼中的硫酸乙酰肝素和透明质酸的含量，有利于提高上皮细胞表面糖萼的稳定性，减少病原菌粘附，增强结肠上皮修复和先天免疫的稳态[53]。
3.3 HMOs直接调节免疫系统
3.3.1 HMOs与免疫细胞作用影响免疫系统
不同结构的HMOs通过与免疫细胞和上皮细胞表面上表达的凝集素或toll样受体（toll-like receptors，TLR）相互作用，刺激婴儿免疫发育。目前发现多种凝集素，包括半乳糖凝集素、唾液酸结合免疫球蛋白型凝集素（Siglecs）、选择素和C型凝集素。它们在不同免疫细胞的表面表达，例如中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和自然杀伤（natural killer cells，NK）细胞[22]。大多数凝集素受体在与多价碳水化合物配体交联后通过多聚化形成信号通路[54]，诱导细胞内信号转导，影响促炎/抗炎细胞因子的表达及诱导适应性免疫反应。而TLR能识别结合肠上皮屏障附近的树突状细胞（dendriticcells，DC），导致T细胞分化或T细胞B细胞相互作用，并通过嗜中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞与影响免疫细胞群和细胞因子分泌的内皮细胞相互作用显示全身效应[48,55]。Xiao等[56]证实HMOs会诱导人单核细胞衍生的树突状细胞部分成熟，并提高白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和IL-10、IL-27的含量，从而刺激B细胞和T细胞增殖，分泌抗体，抑制前炎症细胞因子产生。Goehring等[57]研究了添加2'-FL的配方粉对健康足月婴儿免疫功能生物标志物的影响，结果表明，含有2'-FL组的IL-1α、IL-1β、IL-6以及抗炎IL-1受体拮抗剂的血浆浓度与母乳喂养婴儿相似。He等[58]研究了初乳HMOs对完整的未成熟的人肠黏膜的影响，发现初乳HMOs降低了促炎细胞因子（IL-1β和IL-8）的水平，同时刺激了与组织修复和稳态相关的细胞因子的表达。由此可见，母乳中HMOs会通过信号转导影响炎症细胞因子的表达。
3.3.2 HMOs可维持婴儿免疫系统Th1/Th2反应的平衡
新生儿的免疫系统不成熟，主要依靠Th2型反应而进行体液免疫抵御细胞外病原体不是Th1型细胞免疫。3'-SL则会刺激肠系膜淋巴结CD11c+树突状细胞导致细胞因子释放，促进T辅助细胞向Th1和Th17表型转变[59]。证明HMOs的存在提高了Th1极化的表达，改善婴儿Th1/Th2细胞因子的平衡。HMOs还可抑制Th2极化的表达。Eiwegger等[60]将来自于脐带血的单核细胞暴露于混合的唾液酸化HMO中，发现酸性HMOs会促进IFN-γ和IL-10的产生，抑制Th2反应，使免疫反应转向更平衡的Th1/Th2模式，从而增强对病原体感染的防御并减轻新生儿肠粘膜对食物过敏和自身免疫性疾病的易感性。
3.4 HMOs阻止病原体粘附、抗病毒特性
近年来大量体外和体内研究表明，HMOs具有抗菌、抗病毒特性，这些研究结果让人们认识到了HMOs预防致病性细菌感染的可能性。HMOs可通过充当可溶性受体作为诱饵直接阻止致病性细菌进入。许多病毒、细菌和原生动物病原体会识别细胞，粘附在细胞表面，然后入侵宿主并引起疾病。HMOs的化学结构类似于附着在上皮细胞表面的聚糖，因此病原体和毒素能识别并结合HMOs，而不结合上皮细胞表面的聚糖，从而不粘附目标细胞，避免对胃肠道产生危害[61]。已有动物实验研究证明这一机制有助于婴儿预防感染性腹泻、坏死性小肠结肠炎，并且可以直接抑制B族链球菌的生长，其中，B族链球菌是引起新生儿侵入性细菌感染的主要原因[62−64]。Coppa等[65]将HMOs分为高分子量和低分子量的酸性和中性寡糖，研究表明：酸性部分（主要是3'-SL）对霍乱病毒、大肠杆菌O119和Salmonella fyris的粘附具有抑制作用，中性高分子量部分（主要是LNFP）显著抑制大肠杆菌O119和霍乱病毒的粘附，而中性低分子量部分（主要是3-FL）则拮抗大肠杆菌O119和Salmonella fyris的粘附。研究学者们还证明，2'-FL会抑制空肠杆菌和钙化病毒与肠道粘液的结合[62]，还能抑制空肠杆菌在人类上皮细胞HT-29和HEp-2以及小鼠肠粘膜中诱发的炎症[66]。2′-FL和DSLNT作为母乳中保护肠道健康的成分，在预防及治疗坏死性小肠结肠炎中也起到了积极的作用[67]。吴晓彬等[68]实验证明岩藻糖基化HMOs对无乳链球菌有抗菌作用，但对大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌无效或抗菌效果不佳。
4. 总结与展望
近年来，在婴配粉中补充HMOs已成为婴配粉研发的趋势，部分发达国家已批准将2'-FL、LNnT和3'-SL等六种HMOs作为婴配粉的补充剂。因此，深入了解HMOs的结构与功能至关重要。HMOs的结构多样，在母乳中的组成和含量受母亲自身体质、饮食结构和环境等多种因素影响。目前，部分HMOs已成功实现人工合成，但合成的产量低，分离难度大，且结构复杂的HMOs无法合成，需发掘更多合成HMOs的新型原料和方法，攻坚关键技术，从而实现HMOs的量产。
双歧杆菌、拟杆菌和肠球菌等肠道微生物能分别利用不同种类的HMOs，进而实现自身的定植与生长，对平衡婴儿肠道菌群有重要意义。不同结构的HMOs还会通过与各种细胞上的凝集素或toll样受体相互作用，维持婴儿免疫系统Th1/Th2反应平衡以调节婴儿免疫功能，同时能阻止病原体粘附、抵抗病毒入侵。但是目前除2'-FL、3-FL、3'-SL外，其他种类HMOs结构与功能的研究并不完善，还不完全清晰其在婴儿体内与肠道微生物的互作机制，以及对婴儿免疫系统发育的影响机制，然而几乎每种HMOs都有不同的益处，明确它们中的每一个的活性都将提高HMOs在临床应用上的价值。因此仍需更加深入地研究HMOs的特点及其对婴幼儿健康的影响。此外，HMOs及其代谢产物与某些肠道微生物或母乳中其他活性成分的相互作用，或可在婴幼儿肠道菌群健康和免疫发育方面有更好的效果。未来还可针对母亲特异性个体以及HMOs相关基因型，预测母乳中HMOs的种类与含量，为婴儿进行个性化营养定制。
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中文名称 英文名称 缩写 结构 含量（g/L） 中文名称 英文名称 缩写 结构 含量 g/L 中性岩藻糖基化HMOs 2'-岩藻糖基乳糖 2'-fucosyllactose 2'-FL Fuc-α-1,2-Gal-β-1,4-Glc 0.45~4.04 乳酰-N-岩藻五糖III lacto-N- fucopentaose III LNFP III Gal-β-1,4-（Fuc-α-1,3-）GlcNAc-β-1,3-Gal-β-1,4-Glc 0.05~0.39 3-岩藻糖基乳糖 3-fucosyllactose 3-FL Gal-β-1,4-（Fuc-α-1,3-）Glc 0.07~0.86 乳酰-N-二岩藻糖I lacto-N- difucotetraose I LNDFH I Fuc-α-1,2-Gal-β-1,3-（Fuc-α-1,4-）GlcNAc-β-1,3-Gal-β-1,4-Glc 0.12~1.38 乳酰-N-岩藻五糖I lacto-N-fucopentaose I LNFP I Fuc-α-1,2-Gal-β-1,3-GlcNAc-β-1,3-Gal-β-1,4-Glc 0.52~1.76 二岩藻糖基-乳糖-N-己糖A difucosyl-lacto-N-hexaose a DFLNH a Gal1-4（Fuc1-3）GlcNAc1-6[Gal1-3（Fuc1-4）GlcNAc1-3]Gal1-4Glc 乳酰-N-二岩藻糖II lacto-N-difucotetraose II LNDFH II Gal-β-1,3-（Fuc-α-1,4-）GlcNAc-β-1,3-Gal-β-1,4-（Fuc-α-1,3-）Glc 0.09~0.21 二岩藻糖基-乳糖-N-己糖B difucosyl-lacto-N-hexaose b DFLNH b Gal1-4（Fuc1-3）GlcNAc1-6（Fuc1-2Gal1-3GlcNAc1-3）Gal1-4Glc 0.32~0.63 中性非岩藻糖基化HMOs 乳酰-N-新四糖 lacto-N- neotetraose LNnT Gal-β-1,4-GlcNAc-β-1,3-Gal-β-1,4-Glc 0.10~2.04 乳酰-N-六糖 lacto-N-hexaose LNH Gal-β-1,3-GlcNAc-β-1,3-（Gal-β-1,4-GlcNAc-β-1,6-）Gal-β-1,4-Glc 0.05~0.11 乳酰-N-四糖 lacto-N- tetraose LNT Gal-β-1,3-GlcNAc-β-1,3-Gal-β-1,4-Glc 0.18~1.18 乳酰-N-新六糖 lacto-N-neohexaose LNnH Gal-β-1,4-GlcNAc-β-1,3-（Gal-β-1,4-GlcNAc-β-1,6-）Gal-β-1,4-Glc 0.10~0.18 酸性唾液酸化HMOs 3'-唾液酸乳糖 3'-sialyllactose 3'-SL Sia-α-2,3-Gal-β-1,4-Glc 0.18~0.27 唾液酸-乳糖-N-四糖B sialyl-lacto-N-tetraose b LST b GlcNAc-β-1,3- （Sia-α-2,6-）（Gal-β-1,3-）Gal-β-1,4-Glc 0.10~0.16 6'-唾液酸乳糖 6'-sialyllactose 6'-SL Sia-α-2,6-Gal-β-1,4-Glc 0.38~1.30 唾液酸-乳糖-N-四糖C sialyl-lacto-N-tetraose c LST c Sia-α-2,6-Gal-β-1,4-GlcNAc-β-1,3-Gal-β-1,4-Glc 0.17~0.74 唾液酸-乳糖-N-四糖A sialyl-lacto-N-tetraose a LST a Sia-α-2,3-Gal-β-1,3-GlcNAc-β-1,3-Gal-β-1,4-Glc 0.04~0.14 二唾液酸-乳糖-N-四糖 disialyl-lacto-N-tetraose DSLNT Sia-α-2,6-GlcNAc-β-1,3-（Sia-α-2,3-Gal-β-1,3-）-Gal-β-1,4-Glc 0.49~0.53 
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