Screening and Safety Assessment of a Lactobacillus sp. Strain with High Amylase Production
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摘要: 为筛选到可高效降解淀粉且安全的乳杆菌菌株，本研究首先对5株供试菌株（植物乳杆菌JYI-3913和AS1.555、食淀粉乳杆菌CGMCC1.3395、嗜淀粉乳杆菌CGMCC1.3394和副干酪乳杆菌CGMCC1.12731）开展了产淀粉酶能力初筛、复筛及产酶曲线与生长曲线测定实验，以挑选出产淀粉酶能力最佳的菌株，随后对该菌进行了详细的安全性评价，包括药敏试验、耐药基因检测、质粒检测、溶血试验、产硝基还原酶、产偶氮还原酶及产生物胺能力检测与小鼠急性经口毒性试验等。结果表明：相同培养条件下，食淀粉乳杆菌CGMCC1.3395的淀粉降解透明圈明显，淀粉降解率可达97.28%，淀粉酶活性大小为36.94 U/mL，且该菌株的生长延滞期短而对数期和稳定期长，在供试菌中其综合产淀粉酶能力最佳。该菌株对22种参试抗生素多表现为敏感或中介，仅对其中氨苄西林、卡那霉素及4种氟喹诺酮类抗生素耐药，不含相关耐药基因，不含质粒，因此不具有转移抗生素耐药性基因风险；无溶血性，不产硝基还原酶、偶氮还原酶、组胺和酪胺等有害代谢物；小鼠在14 d喂养期间，正常生长、体重增加，该菌株为无毒级。综上，食淀粉乳杆菌CGMCC1.3395具有极强的产淀粉酶能力和良好的安全性，本研究可为该菌株在富淀粉类食品发酵上的安全应用奠定理论依据。Abstract: In order to identify a Lactobacillus sp. strain with efficient and safe in starch degradation, this study analyzed five distinct strains: Lactiplantibacillus plantarum JYI-3913 and AS1.555, Lactobacillus amylovorus CGMCC1.3395, Lactobacillus amylophilus CGMCC1.3394, and Lactobacillus paracasei CGMCC1.12731. The preliminary screening and re-screening for amylase production capabilities, the determination of enzyme production curve and growth curve were carried out to select the strain with the best ability to produce amylase. Subsequently, a detailed safety evaluation of the strain was carried out, including drug sensitivity test, drug resistance genetic testing, plasmid detection, hemolysis test, nitroreductase production, azoreductase production and amine production capacity detection, and acute oral toxicity test in mice. Results showed that, under the same culture conditions, the starch degradation transparent zone of L. amylovorus CGMCC1.3395 exhibited a clear transparent zone of starch degradation. Its starch degradation rate and amylase activity were 97.28% and 36.94 U/mL, respectively. And this strain displayed a relatively brief lag phase, while extending the log phase and stationary phase. Overall, this strain demonstrated superior integrated amylase production capabilities when compared to the other strains under investigation. In terms of antibiotic sensitivity, the selected strain exhibited sensitivity or intermediate sensitivity to the majority of the 22 tested antibiotics, with resistance observed for ampicillin, kanamycin, and four fluoroquinolone antibiotics. Moreover, this strain showed no associated drug-resistance genes and plasmids, thereby eliminating the risk of antibiotic-resistance gene transmission. It also lacked a hemolytic effect and did not produce potentially harmful metabolites such as nitroreductase, azoreductase, histamine, and tyramine. Mice displayed normal growth and weight gain over a 14 day feeding period, indicating the non-toxicity of the strain. In conclusion, L. amylovorus CGMCC1.3395 demonstrated a potent and safe capability for amylase production. These findings provide a theoretical foundation for the safe employment of this strain in the fermentation of starch-rich foods.
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Keywords:
- Lactobacillus /
- amylase /
- antibiotic resistance /
- acute oral toxicity test /
- safety assessment
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乳杆菌（Lactobacillus spp.）属于革兰氏阳性、厌氧或兼性厌氧、无芽孢杆菌，能发酵碳水化合物生成乳酸，是乳酸菌大家族的一种，发酵的适宜温度为30~40 ℃、pH为5.5～5.8[1]。乳杆菌除了是公认的益生菌，具有改善肠道菌群结构、增强机体免疫、抑制病原菌生长、降低胆固醇改善血脂等益生功能，在食品发酵应用中还具有改善食品口感、营养和货架期等优点[2-4]。针对富淀粉类食品，相比商业酵母，乳杆菌发酵对改善谷物口感、淀粉结构质地和营养更有优势且能增加其风味[5-7]。然而，乳杆菌属虽普遍分解糖类底物能力强，可直接利用淀粉发酵的菌种却有限，目前已知的有产淀粉酶能力的菌种主要有植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）、食淀粉乳杆菌（Lactobacillus amylovorus）、嗜淀粉乳杆菌（Lactobacillus amylophilus）和副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）等[8-9]。将酶活力单位（U/mL）统一定义为每小时能降解淀粉生成1 mg麦芽糖所需的酶量，在适宜条件下，国内外学者鉴定的上述四种乳杆菌代表的淀粉酶活力大小如下：张建华等[10]从淀粉质发酵样品中筛选出的株植物乳杆菌CGMCC14177为15.89 U/mL；Nakamura等[11]于牛粪-玉米混合发酵物中发现分离的食淀粉乳杆菌CGMCC1.3395为25 U/mL；Vishnu等[12]从玉米淀粉加工废料中分离出的嗜淀粉乳杆菌GV6为10.84 U/mL；郭浩男等[13]从自然发酵甘薯酸浆中分离出的副干酪乳杆菌L1为23.1 U/mL。当前，由于产淀粉酶的乳杆菌种类有限且关于其淀粉酶活性的比较研究也较少，这极大限制了乳杆菌在富淀粉类食品上的发酵应用[14]。因此，评价和筛选高产淀粉酶的乳杆菌是解决问题的关键。
此外，限制乳杆菌在食品发酵应用的原因还有其安全性问题。虽然有已大量商业乳杆菌安全应用于食品发酵，但是近年来一些报道也暴露了部分乳杆菌存在安全隐患，如：导致人体败血症发生、产生抗药性、通过食物链传递耐药基因和代谢过程产生危害人体健康的有毒有害代谢物（如生物胺、硝基还原酶、偶氮还原酶）等[15-17]。最近，Moravkova等[18]分析了从野猪和家猪消化道分离出的28株食淀粉乳杆菌的抗生素耐药性和耐药基因，发现家猪中分离出的食淀粉乳杆菌普遍对四环素、红霉素和氨苄西林耐药，且存在四环素耐药基因tetW和红霉素耐药基因ermB。因此，将没有长期安全使用史的乳杆菌应用于食品发酵前，对其进行安全评价极为重要。
为了在短期内获得一株产淀粉酶能力好且安全的乳杆菌应用于本团队后续的谷物发酵课题，本研究从已报道的用于谷物淀粉品质改良且便于购买的乳杆菌商业菌株中初步挑选了5株进行比较，包括2株植物乳杆菌，食淀粉乳杆菌、嗜淀粉乳杆菌和副干酪乳杆菌各1株[13,19-20]。本研究拟通过对供试菌株产淀粉酶能力的初筛、复筛及生长特性的评价，筛选出综合产淀粉酶能力最强的菌株，之后对该菌株开展详细的安全性评价，具体包括抗生素敏感性、抗生素耐药基因、质粒检测、溶血性、硝基还原酶活性、偶氮还原酶活性、生物胺产生能力及急性毒性等试验，旨在为乳杆菌在富淀粉类食品发酵的安全应用提供依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
植物乳杆菌 JYI-3913（菌株1） 山东中科嘉亿生物工程有限公司；植物乳杆菌AS1.555（菌株2） 上海保藏生物技术中心；食淀粉乳杆菌CGMCC1.3395（菌株3）、嗜淀粉乳杆菌CGMCC1.3394（菌株4）、副干酪乳杆菌CGMCC1.12731（菌株5） 中国普通微生物菌种保藏管理中心。菌株1~3均为冻干粉，菌株4、5为菌液；可溶性淀粉、蛋白胨、PBS磷酸盐缓冲液、柠檬酸氢二铵、无水磷酸氢二钾、MRS琼脂、吐温−80、MRS肉汤、革兰氏染色试剂盒、DNS试剂、牛肉膏、琼脂粉、硫胺素、酵母粉、氯化钠、葡萄糖、硫酸镁、硫酸锰、硫酸亚铁、碳酸钙、吡哆醛-5-磷酸、D1600细菌基因组DNA提取试剂盒、D1110细菌质粒提取试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；DNA分子量标准Ladder H1-K（100~3000 bp）（Marker）、SanPrep核酸纯化套件（质粒提取） 生工生物工程（上海）股份有限公司；无水氯化钙 国药集团化学试剂有限公司；菌落直接PCR试剂盒、Seamless Cloning Kit（无缝克隆试剂盒） 上海碧云天生物技术有限公司；LB琼脂、LB营养琼脂（Miller）、LB肉汤（Miller） 山东拓普生物工程有限公司；Lugols碘液 南京森贝伽生物科技有限公司；血平板培养基 海博生物科技有限公司；直接蓝71、组氨酸、酪氨酸、溴甲酚紫、抗生素药敏纸片 比克曼生物科技有限公司；健康SPF级受试小鼠 昆明种（动物生产许可证号SCXK（粤）2022-0002，动物合格证号44007200105339，动物使用许可证号为SYXK（粤）2021-0156，动物福利伦理审查批文号GT-IACUC202206304），雌雄各半共20只，单只标准体重为18~22 g，广东省医学实验动物中心。
UV1800PC紫外分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；BSD-250振荡培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司；LDZF-50KB-Ⅱ型立式压力蒸汽灭菌器 海申安医疗器械厂；DYY-6C DNA电泳仪电源、DYCP-31DN水平电泳槽、DYCZ-24K垂直电泳槽、WD-9413B凝胶成像仪 北京六一生物科技有限公司；T100梯度PCR仪 伯乐生命医学产品（上海）有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 菌株活化与扩大培养
菌株1~3的活化：将0.01 g的菌株冻干粉称量入一个装有10 mL无菌生理盐水（0.85% NaCl）的试管内，均质1~2 min。菌液浓度稀释100倍后，吸取0.1 mL的均匀涂抹在MRS固态培养基表面于37 ℃培养24 h，挑取单菌落于MRS液体培养基于37 ℃厌氧培养24 h。
菌株4~5的活化：取0.3 mL菌液均匀涂布于MRS固体培养基表面在37 ℃恒温培养传代至3代，从培养基中的挑选单菌落接种到其MRS液体培养基中，在37 ℃恒温培养24~36 h。
扩大培养：将所有供试菌株按2%接种量在MRS液体培养基分别进行扩大培养（37 ℃，24~36 h），菌液的浓度达1~2×108 CFU/mL即可短期暂存于4 ℃冰箱备用。
1.2.2 高产淀粉酶乳杆菌筛选
1.2.2.1 产淀粉酶菌株初筛
采用淀粉圈显色法[21]。挑取培养好的单菌落接种到MRS液体培养基，在37 ℃厌氧培养24 h。吸取5 μL菌液滴在MRS-1%淀粉固体培养基（配方详见文献[10]）中央，37 ℃厌氧培养48 h，吸取一定量的Lugols碘液滴在菌落边缘，待充分渗透之后，观察菌落周边的淀粉透明圈，测量菌落（d）和透明圈（D）的直径。
1.2.2.2 产淀粉酶菌株复筛
采用碘量法测定菌株淀粉降解率[22]。将试验菌株接种至MRS-1%淀粉液体培养基（配方详见文献[10]），接种量为2%，37 ℃厌氧培养24 h后，吸取3000 μL菌液，4500 r/min离心15 min。吸取上清液400 μL测其淀粉剩余量，加入600 μL PBS缓冲溶液，混匀后加入碘液2000 μL，振荡显色后取2000 μL样品，转入比色皿，在580 nm波长处测定吸光度。将其代入标准曲线方程Y=0.0063X+0.0078（R2=0.9993）可计算淀粉含量（Y代表OD值、X代表淀粉含量，μg），淀粉降解率公式如下。标准曲线由100 μg/mL可溶性淀粉标准溶液稀释的梯度工作液制得。
淀粉降解率(%)=C2−C1C2×100 式中：C2，培养基原淀粉含量，μg；C1，培养基淀粉剩余量，μg。
1.2.2.3 菌株产酶曲线测定
参考顾旭峰等[21]方法测定供试菌株的淀粉酶活性。将供试菌株以2%的接种量接种至MRS液体培养基中扩增，分别取6、12、18和24 h的菌液进行酶活力测定。标准曲线用麦芽糖制作，本试验中标准曲线方程为Y=0.2625X−0.0053（R2=0.9984），Y代表OD值，X代表麦芽糖质量（mg），将菌株待测液的吸光值代入方程可得麦芽糖生成量，再代入如下公式换算出淀粉酶酶活力大小。
酶活(U/mL)=m×nt 式中：m，麦芽糖质量，mg；n，酶液稀释倍数；t，反应时间，h。
1.2.2.4 菌株生长曲线测定
将供试菌种按1%接种量将菌液加入MRS液体培养基中，在37 °C、120 r/min摇床中培养36 h，期间每2 h取1次培养液于600 nm波长测定吸光值，具体操作参见程鑫等[20]方法。
1.2.3 菌株安全性评价
对最终筛选到的一株高产淀粉酶乳杆菌开展系统的安全性评价，具体方法如下。
1.2.3.1 药敏试验
试验参照K-B药敏纸片琼脂扩散法进行操作，抗生素耐药性结果分为敏感、中介与耐药，判定依据参照临床和实验室标准协会（Clinical and laboratory standards in stitute，CLSI）标准[23]。
1.2.3.2 耐药基因检测
对卡那霉素抗性基因aph、氟喹诺酮类抗性基因qnr及β-内酰胺类抗性基因bla-1、bla-2等4个乳酸菌常见的抗生素抗性基因进行验证。待测菌株的基因组DNA提取参照试剂盒说明进行。引物序列设计、PCR扩增体系、PCR反应条件及PCR产物电泳等完全参考黄晓棠[24]的方法。
1.2.3.3 质粒提取试验
参照细菌质粒提取试剂盒说明进行。通过1%琼脂糖凝胶电泳对供试菌株质粒DNA检测，含质粒菌株Lactococus lactis NZ3900（pBBR1MCS5-Tac-EGFP）为对照。
1.2.3.4 溶血试验
将活化好的乳杆菌菌液用接种针在血平板培养基上刺穿接种3~6处，使细菌被接种到培养基深处，在37 ℃培养箱中倒置培养1 d，观察是否出现溶血现象[23]。阳性对照参考血平板培养基说明书提供的肺炎链球菌在血平板上的α溶血及蜡样亚孢杆菌的β溶血试验结果，不再另设对照试验。
1.2.3.5 产硝基还原酶能力检测
待测菌的菌液按1%接种量接种于硝基还原酶检测培养基中，37 ℃恒温培养3 d，依次向培养基中加入α-萘胺溶液和对氨基苯甲磺酸溶液，观察颜色变化；用大肠杆菌DH5α作为阳性对照组，不接种细菌的培养基为空白对照CK[15]。
1.2.3.6 产偶氮还原酶能力检测
将过夜活化的乳杆菌菌株涂布于含有5 mg/L直接蓝71固体培养基中，置于37 ℃培养3 d，观察菌落周边是否有明显水解圈[15]。
1.2.3.7 产生物胺能力检测
本试验检测培养基配方及实施方法参考杨埔等[15]方法。首先将供试乳杆菌过夜活化，然后分别转接到含有1 g/L组氨酸、1 g/L酪氨酸和0.05 g/L的吡哆醛-5-磷酸的液体培养基中传代培养，每24 h转接一次，以诱导产生相应的脱羧酶。转接10次之后分别在酪胺检测平板和组胺检测平板上涂布，培养3 d之后观察培养基的颜色变化。实验组培养基加氨基酸接种菌液，对照组培养基不加氨基酸接种菌液。溴甲酚紫为培养基中的酸碱指示剂，若测试菌株能生成生物胺，会使培养基中pH升高，颜色由黄色变为紫或紫红色。
1.2.3.8 小鼠急性经口毒性试验
乳杆菌的小鼠急性经口毒性试验委托广东省科学院微生物研究所微生物分析检测中心完成，试验方法为《GB 15193.3-2014食品安全国家标准 急性经口毒性试验》[25]。受试物准备：将菌株3接种于MRS培养基后，在36 ℃培养箱中培养3 d，最后用生理盐水将菌液浓度调整至2.0×108~2.0×109 CFU/mL，称取该菌液5.0 g，加入生理盐水定容到20 mL混匀备用。给喂菌液前，小鼠需禁食6 h但可自由饮水。经口灌胃1次，灌胃量为0.4 mL/20 g·BW，禁食2 h后正常喂食。在14 d观察期内，记录小鼠的生长情况，若有小鼠死亡记录其数量和时间。于给药0、7、14 d称量体重，分析最大耐受量MTD和半致死量LD50，判定经口毒性级别。
1.3 数据处理
方差分析和差异显著性分析采用SPSS 22.0，数据表示方式：平均值±标准偏差（ˉx±SD，n=3），作图采用Origin 2020。
2. 结果与分析
2.1 高产淀粉酶乳杆菌筛选
2.1.1 产淀粉酶菌株初筛
将供试菌株接种于淀粉显色培养基上在37 ℃培养箱中生长48 h后，观察并记录菌落周边透明圈显色及大小情况。透明圈是由培养基中参与显色反应的淀粉被酶解使其蓝紫色消失而形成，据此，可以对菌株产淀粉酶能力进行初步推断。图1显示，菌株3和菌株4的透明圈最大，其次是菌株1和菌株2，菌株5无透明圈。进一步测量参试菌株的淀粉透明圈与菌落直径大小：菌株3的D/d值最大，其次是菌株4（表1）。初步推知菌株中产淀粉酶能力较强的为菌株3与菌株4。
表 1 供试菌株生长48 h的菌落大小及水解圈直径Table 1. Colony size and hydrolytic circle diameter of tested strains after 48 h of growth菌株编号 菌落直径（d，mm） 透明圈直径（D，mm） D/d 菌株1 7.63±0.12b 8.72±0.27c 1.15±0.06c 菌株2 7.75±0.07ab 8.39±0.30c 1.08±0.01c 菌株3 7.37±0.16c 19.27±0.50a 2.62±0.07a 菌株4 7.84±0.08a 16.48±0.92b 2.10±0.08b 菌株5 7.44±0.06c 0.00±0.00d 0.00±0.00d 注：同列中不同字母代表差异显著（P<0.05）。 2.1.2 产淀粉酶菌株复筛
将试验菌株接种至MRS-1%淀粉液体培养基，接种量为2%，37 ℃密闭培养24 h后，采用碘量法检测淀粉降解率，发现菌株3淀粉降解率最大，为97.28%±0.12%，说明其酶解淀粉能力最强。其次是菌株4，淀粉降解率为30.44%±0.98%。剩余菌株的淀粉降解率均低于15%，酶解淀粉能力较差（图2）。
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图 2 供试菌株的淀粉降解能力注：图中不同字母代表差异显著（P<0.05）。Figure 2. Starch degradation ability of tested strains2.1.3 菌株的产酶曲线
试验菌株在发酵时淀粉酶的活性大小及变化趋势如图3所示。菌株1~5的酶活力最大值分别为：21.23±0.86、25.90±0.59、36.94±0.86、33.90±0.72和29.04±0.87 U/mL，菌株3的酶活力最大产酶能力最强，其次是菌株4。除了菌株1的最大产酶时间为18 h外，其余菌株的最大产酶时间均为12 h，之后菌株的酶活力开始下降。这可能是由于培养时间延长，培养基营养供给不足、pH降低等因素抑制菌种活力导致。
2.1.4 菌株的生长曲线
供试菌株的生长曲线如图4。菌株1的延滞期为0~4 h，对数生长期为4~12 h，12~26 h为稳定期，26 h以后为衰亡期。菌株2的延滞期为0~10 h，以后进入对数生长期，24 h后达到稳定期，超过30 h后进入衰亡期。菌株3的延滞期为0~6 h，对数生长期为6~12 h，之后渐转为稳定期，30 h以后进入衰亡期。菌株4经10 h的延滞期后进入快速增长，10~12 h为对数生长期，12~26 h为稳定期，26 h后逐步进入衰亡期。同菌株1相似，菌株5的延滞期为0~4 h，4~16 h为对数生长期，26 h后进入衰亡期。供试菌株进入稳定期后，菌株4的OD值显著低于其余菌株，其余菌株OD值则较为接近，说明菌株4的生物产量较低。
综上，结合供试菌株的产淀粉酶能力初筛、复筛、产酶曲线和生长曲线分析结果，菌株3食淀粉乳杆菌CGMCC1.3395的综合产淀粉酶能力最佳，其淀粉降解率高达97.28%、适宜条件下淀粉酶酶活性高达36.94 U/mL。菌株3有应用于富淀粉类食品进行工业发酵的极大潜力。
2.2 菌株的安全性评价
2.2.1 药敏试验
本试验通过K-B药敏纸片法分析了菌株3对11类共22种常见抗生素药物的耐药性，判定标准和检测结果如表2所示：菌株3对青霉素、头孢曲松、头孢噻肟、阿米卡星、庆大霉素、链霉素、四环素、氯霉素、林可霉素、克林霉素、红霉素、替考拉宁、万古霉素、利福平等14种抗生素敏感，对新霉素、多粘菌素B敏感性为中介，而对氨苄西林、卡那霉素及所有供测氟喹诺酮类抗生素表现为耐药。
表 2 食淀粉乳杆菌的抗生素药敏试验结果Table 2. Results of Lactobacillus amylovorus antibiotic sensitivity test抗生素类别 抗生素药品 纸片含药量（μg/片） 抑菌圈直径判定标准（mm） 抑菌圈直径（mm） 敏感性 敏感（S） 中介（I） 耐药（R） 均值 SD 青霉素类 青霉素 10 ≥29 − ≤28 45.23 0.25 S 氨苄西林/氨苄青霉素 10 ≥29 − ≤28 12.06 0.55 R 头孢类 头孢曲松/菌必治 30 ≥26 23~25 ≤22 27.92 0.48 S 头孢噻肟 30 ≥23 15~22 ≤14 38.12 0.18 S 氨基糖苷类 丁胺卡那/阿米卡星 30 ≥17 15~16 ≤14 18.04 0.45 S 卡那霉素 30 ≥18 14~17 ≤13 10.84 0.38 R 新霉素 30 ≥16 13~15 ≤12 14.23 0.63 I 庆大霉素 10 ≥15 13~14 ≤12 19.42 0.44 S 链霉素 10 ≥15 12~14 ≤11 16.13 0.46 S 四环素类 四环素 30 ≥19 15~18 ≤14 41.55 0.36 S 苯丙醇类 氯霉素 30 ≥18 13~17 ≤12 42.03 1.02 S 氟喹诺酮类 环丙沙星 5 ≥21 16~20 ≤15 9.37 0.19 R 诺氟沙星 10 ≥17 13~16 ≤12 7.46 0.10 R 氧氟沙星 5 ≥18 15~17 ≤14 7.52 0.21 R 左氧氟沙星 5 ≥19 16~18 ≤15 9.42 0.17 R 林可胺类 林可霉素 2 ≥31 24~30 ≤23 36.85 0.48 S 克林霉素/氯洁霉素 2 ≥21 15~20 ≤14 43.82 0.45 S 大环内酯类 红霉素 15 ≥23 14~22 ≤13 41.89 0.63 S 糖肽类 替考拉宁/壁霉素 30 ≥14 11~13 ≤10 27.16 0.51 S 万古霉素 30 ≥17 13~16 ≤14 26.51 1.14 S 安沙霉素类 利福平 5 ≥20 17~19 ≤16 28.19 1.00 S 脂肽类 多粘菌素B 300 ≥12 8~11 ≤7 10.96 0.67 I 注：“−”表示无有效数据。 2.2.2 耐药基因检测
由于在药敏实验中菌株3表现为对氨苄西林、卡那霉素及氟喹诺酮类抗生素耐药，为验证菌株3是否含有相关耐药基因，对卡那霉素抗性基因aph、氟喹诺酮类抗性基因qnr及氨苄西林抗性基因（β-内酰胺类抗性基因bla-1、bla-2）进行了检测。图5为耐药基因检测的电泳，结果表明菌株3中不含上述抗生素相关的耐药基因，不具有传递上述耐药基因的潜在风险。Jing等[26]于2022年底的最新研究公布了菌株3的全基因组序列。为了进一步验证菌株3是否含有抗生素耐药基因，本研究将其基因组信息带入综合抗生素抗性数据库（Comprehensive Antibiotic Resistance Database，CARD，https://card.mcmaster.ca/）中的耐药基因辨识器（Resistance Genes Identifier，RGI）智能检索菌株3基因组序列中的耐药基因[27]，检索结果为0，再次验证了菌株3不含抗生素耐药基因。
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图 5 耐药基因PCR扩增琼脂糖电泳图注：1.卡那霉素aph；2.氟喹诺酮类qnr；3.内酰胺类bla-1；4.内酰胺类bla-2。Figure 5. Agarose electrophoresis map of drug resistance gene PCR amplification2.2.3 质粒提取结果
对菌株3的质粒DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，含质粒的阳性对照菌株为Lactococus lactis NZ3900（pBBR1MCS5-Tac-EGFP），结果（见图6）表明对照菌株所在泳道出现电泳条带，而菌株3所在泳道无电泳条带，说明菌株3不含质粒，无法水平转移耐药基因至人体内，可安全应用[24]。
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图 6 质粒提取琼脂糖电泳图注：lane1为Lactococcus lactis NZ3900（pBBR1MCS5-Tac-EGFP）；lane2为食淀粉乳杆菌CGMCC1.3395。Figure 6. Agarose electrophoresis map of plasmid extraction2.2.4 溶血试验
菌株安全性检测必不可少的指标之一有溶血性检测，食用有溶血性的细菌能破坏红细胞、导致败血症。细菌溶血性常用检测方法为血琼脂平板培养法。菌株的溶血性可分为3类，它们的溶血能力和血琼脂平板培养菌落有明显差异：α溶血菌的菌落周围有草绿色溶血环，致病力低；β溶血菌的菌落周围有透明溶血圈，致病力强；γ溶血菌的菌落周围无溶血圈，无溶血性，是安全的[23]。菌株3在血琼脂平板上于37 ℃密闭培养24 h后，其菌落周围无溶血圈属于γ溶血菌，说明该菌株无溶血能力，无致病性（图7c）。
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图 7 菌株溶血试验结果注：a为肺炎链球菌在血平板上的α溶血现象；b为蜡样亚孢杆菌的β溶血现象；c为菌株3的γ溶血现象；a和b作为阳性对照均引用海博生物血琼脂培养基说明书。Figure 7. Results of hemolysis experiments of strains2.2.5 产硝基还原酶能力检测
由图8可知，接种大肠杆菌DH5ɑ的培养基颜色由黄色变为红色，而接种菌株3的培养基颜色不发生改变。说明菌株3不具有产硝基还原酶的能力[24]，不能使环境中的硝酸盐还原为有害代谢物亚硝酸盐。
2.2.6 产偶氮还原酶能力检测
部分细菌具有产偶氮还原酶能力，可使偶氮复合物分解为芳香胺。芳香胺具有毒性，吸入、误食或皮肤接触进入人体会产生毒害，如果长期大剂量摄入芳香胺甚至有致癌的风险[15,28]。因此，对益生菌的产偶氮还原酶能力进行安全性评价十分重要。将过夜活化的菌株3涂布在含5 mg/L直接蓝71固体培养基上，放入37 ℃培养箱培养3 d，观察到其菌落周围并无明显的水解圈，说明该菌株无产偶氮还原酶能力（图9）。
2.2.7 产生物胺能力检测
部分乳酸菌有使氨基酸脱羧生成生物胺的能力，人体如过多摄入会导致头痛、呼吸道疾病、心悸、高血压和血压下降等，生物胺中组胺和酪胺的毒性最强[29]。在菌株3的组氨酸和酪氨酸实验组培养基中均未观察到培养基的颜色由黄色变为紫或紫红色的现象（图10），说明该菌株无法在生长期间代谢产生有害的组胺和酪胺从而使培养基的pH升高变色，该菌株不具有组氨酸和酪氨酸脱羧能力。
2.2.8 小鼠急性经口毒性试验
急性经口毒性试验可检测被试动物在短期内经口给予待测样品后短期内的健康损害程度，是毒性检测的初步阶段[30]。受试小鼠经口灌药后，本研究在14 d观察期内记录小鼠的体重变化和生长情况，结果表明（表3）：雌性小鼠体重由初始的19.7 g增重至32.8 g，雄性小鼠体重由初始的20.1 g增重至40.2 g，小鼠全部正常存活、饮水和进食正常、皮毛正常，未见明显中毒症状。菌株3的LD50>5000 mg/kg·BW，即杀死一半试验小鼠的有毒物质的计量>5000 mg/kg·BW，无需再进行更高剂量试验。参照试验方法中的国标判定标准，菌株3可认定为无毒。
表 3 急性经口毒性试验结果Table 3. Results of acute oral toxicity test性别 剂量
（mg/kg·BW）动物数
（只）始重
（g）终重
（g）死亡数
（只）MTD
（mg/kg·BW）LD50
（mg/kg·BW）相当于人的致死量
（g/人）雌性 5000 10 19.7±0.3 32.8±0.6 0 >5000 >5000 500 雄性 5000 10 20.1±0.3 40.2±0.4 0 >5000 >5000 500 3. 讨论与结论
由于大多数乳杆菌不具有降解淀粉能力，因此筛选和评价具有高产淀粉酶能力的菌株具有重要意义[14]。本研究通过对5株供试菌株的产淀粉酶能力进行综合分析，筛选出高产淀粉酶的食淀粉乳杆菌CGMCC1.3395。该菌株淀粉水解圈明显，淀粉降解率高达97.28%，适宜条件下培养12 h后淀粉酶活力达36.94 U/mL，且菌株生长延滞期短而对数期和稳定期长，极具有高产淀粉酶潜力。张建华团队报道过株植物乳杆菌CGMCC14177也具有高产淀粉酶能力。本研究挑选的食淀粉乳杆菌CGMCC1.3395的培养条件与之相似，但淀粉酶活力约为该菌株两倍。此外，对比二者的生长曲线，可发现进入稳定期后，前者的菌液OD值最高不超过1.6，而后者菌液OD值平均高于1.5最高点接近2.1，后者菌株产量也更好[10]。据报道乳杆菌的淀粉酶活性具有菌株特异性，其大小依赖于淀粉合成基因淀粉结合区域序列的多样性[31]。因此推测该结果可能与食淀粉乳杆菌CGMCC1.3395的淀粉合成基因多样性更丰富有关。Slavica等[32]研究食淀粉乳杆菌CGMCC1.3395的碳代谢特点，就曾发现该菌株的淀粉酶基因表达不连续，有多种未知路线的碳利用途径将淀粉水解为寡糖。Pompeyo等[33]报道过食淀粉乳杆菌CGMCC1.3395的淀粉酶活力，在与本文相似条件培养48 h后，其大小为25 U/mL，低于本研究结果。这可能是由于前人研究中随发酵时间延长，菌株培养基中的pH降低抑制了淀粉酶活力。除培养时间外，其它可能影响菌株淀粉酶活性的因素还有培养基初始pH、温度、碳源、含碳量、接种量、无机离子等多种因素[34]。未来应用该菌株于不同来源的富淀粉类食物发酵前，还需进一步实验优化其培养条件，提高产淀粉酶效率和稳定性。
长期以来食淀粉酶乳杆菌CGMCC1.3395缺乏系统的菌株安全性评价，限制了它在食品发酵上的广泛应用。本研究参考FAO/WHO制定的《用于食品的益生菌安全性评价指导原则》[35]，对该菌株开展了系列菌株安全性评价实验，结果表明：该菌株具有广泛的抗生素敏感性，不含耐药基因和质粒，不具有转移耐药基因的风险；且该菌种在溶血试验、硝基还原酶活性、产偶氮还原酶能力及产生物胺能力等检测均表现阴性，说明不具有溶血性和产硝基还原酶、偶氮还原酶、组胺、酪胺等有害代谢物的风险；另外小鼠急性经口毒性试验也证实该菌株为无毒菌株。以上，充分证明了该菌株的安全性。本研究中食淀粉酶乳杆菌CGMCC1.339对氨苄西林、卡那霉素及氟喹诺酮类抗生素耐药却不含相关耐药基因，出现表型药敏和基因型药敏检测结果不一致的现象。根据前人关于结核分枝杆菌出现的类似现象分析，这可能是由于抗生素耐药性相关基因的部分区域发生了位点突变导致的基因型与表型药敏结果不一，此外这种现象也可能与低水平耐药机制有关[36]。后续可通过大量收集自然的或人工创制食淀粉酶乳杆菌CGMCC1.339的突变体材料结合全基因组序列分析讨论不同突变位点与抗生素耐药表型的关系，同时也寻求更先进的方法精准检测抗生素最低抑菌浓度，最终解释这种不一致的内在原因，更精准判断菌株的抗生素耐药性风险。
综上，食淀粉乳杆菌CGMCC1.3395是产淀粉酶能力强且安全无毒的益生菌株。本研究为该菌株在富淀粉类食品中的应用提供了较详尽的实验数据和理论参考。食品行业的发酵原料有很多如谷物一样富含淀粉，未来该菌株在富淀粉类食品原料发酵中的广泛应用，极具开发价值高，市场前景很好。
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图 2 供试菌株的淀粉降解能力
注：图中不同字母代表差异显著（P<0.05）。
Figure 2. Starch degradation ability of tested strains
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图 5 耐药基因PCR扩增琼脂糖电泳图
注：1.卡那霉素aph；2.氟喹诺酮类qnr；3.内酰胺类bla-1；4.内酰胺类bla-2。
Figure 5. Agarose electrophoresis map of drug resistance gene PCR amplification
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图 6 质粒提取琼脂糖电泳图
注：lane1为Lactococcus lactis NZ3900（pBBR1MCS5-Tac-EGFP）；lane2为食淀粉乳杆菌CGMCC1.3395。
Figure 6. Agarose electrophoresis map of plasmid extraction
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图 7 菌株溶血试验结果
注：a为肺炎链球菌在血平板上的α溶血现象；b为蜡样亚孢杆菌的β溶血现象；c为菌株3的γ溶血现象；a和b作为阳性对照均引用海博生物血琼脂培养基说明书。
Figure 7. Results of hemolysis experiments of strains
表 1 供试菌株生长48 h的菌落大小及水解圈直径
Table 1 Colony size and hydrolytic circle diameter of tested strains after 48 h of growth
菌株编号 菌落直径（d，mm） 透明圈直径（D，mm） D/d 菌株1 7.63±0.12b 8.72±0.27c 1.15±0.06c 菌株2 7.75±0.07ab 8.39±0.30c 1.08±0.01c 菌株3 7.37±0.16c 19.27±0.50a 2.62±0.07a 菌株4 7.84±0.08a 16.48±0.92b 2.10±0.08b 菌株5 7.44±0.06c 0.00±0.00d 0.00±0.00d 注：同列中不同字母代表差异显著（P<0.05）。 
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表 2 食淀粉乳杆菌的抗生素药敏试验结果
Table 2 Results of Lactobacillus amylovorus antibiotic sensitivity test
抗生素类别 抗生素药品 纸片含药量（μg/片） 抑菌圈直径判定标准（mm） 抑菌圈直径（mm） 敏感性 敏感（S） 中介（I） 耐药（R） 均值 SD 青霉素类 青霉素 10 ≥29 − ≤28 45.23 0.25 S 氨苄西林/氨苄青霉素 10 ≥29 − ≤28 12.06 0.55 R 头孢类 头孢曲松/菌必治 30 ≥26 23~25 ≤22 27.92 0.48 S 头孢噻肟 30 ≥23 15~22 ≤14 38.12 0.18 S 氨基糖苷类 丁胺卡那/阿米卡星 30 ≥17 15~16 ≤14 18.04 0.45 S 卡那霉素 30 ≥18 14~17 ≤13 10.84 0.38 R 新霉素 30 ≥16 13~15 ≤12 14.23 0.63 I 庆大霉素 10 ≥15 13~14 ≤12 19.42 0.44 S 链霉素 10 ≥15 12~14 ≤11 16.13 0.46 S 四环素类 四环素 30 ≥19 15~18 ≤14 41.55 0.36 S 苯丙醇类 氯霉素 30 ≥18 13~17 ≤12 42.03 1.02 S 氟喹诺酮类 环丙沙星 5 ≥21 16~20 ≤15 9.37 0.19 R 诺氟沙星 10 ≥17 13~16 ≤12 7.46 0.10 R 氧氟沙星 5 ≥18 15~17 ≤14 7.52 0.21 R 左氧氟沙星 5 ≥19 16~18 ≤15 9.42 0.17 R 林可胺类 林可霉素 2 ≥31 24~30 ≤23 36.85 0.48 S 克林霉素/氯洁霉素 2 ≥21 15~20 ≤14 43.82 0.45 S 大环内酯类 红霉素 15 ≥23 14~22 ≤13 41.89 0.63 S 糖肽类 替考拉宁/壁霉素 30 ≥14 11~13 ≤10 27.16 0.51 S 万古霉素 30 ≥17 13~16 ≤14 26.51 1.14 S 安沙霉素类 利福平 5 ≥20 17~19 ≤16 28.19 1.00 S 脂肽类 多粘菌素B 300 ≥12 8~11 ≤7 10.96 0.67 I 注：“−”表示无有效数据。
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表 3 急性经口毒性试验结果
Table 3 Results of acute oral toxicity test
性别 剂量
（mg/kg·BW）动物数
（只）始重
（g）终重
（g）死亡数
（只）MTD
（mg/kg·BW）LD50
（mg/kg·BW）相当于人的致死量
（g/人）雌性 5000 10 19.7±0.3 32.8±0.6 0 >5000 >5000 500 雄性 5000 10 20.1±0.3 40.2±0.4 0 >5000 >5000 500
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