Fermentation Conditions Optimization and Components Analysis of Antimicrobial Substances-producing Endophytic Fungus CWJ01 from Acanthopanax senticosus
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摘要: 从刺五加叶中分离得到一株具有较好抑菌活性的内生真菌CWJ01，为提高该菌株发酵液抑菌活性，并探究其抑菌活性物质基础，在单因素实验的基础上，结合抑菌活性进行正交试验优化刺五加内生真菌CWJ01的发酵条件，并采用柱色谱法对其含有的次生代谢产物进行分离，结合形态学及ITS序列分析法，对内生真菌CWJ01进行菌种鉴定。结果表明，CWJ01的最适发酵工艺条件：以PDB为基础培养基，以2%葡萄糖为碳源，以1%蛋白胨为氮源，培养基初始pH为7.0，培养基装液量为60%，菌株接种量为5%，空气浴振荡器转速为140 r/min，温度为28 ℃，连续培养15 d；在最适发酵条件下，CWJ01 发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径可达27.48±0.17 mm；从内生真菌CWJ01发酵液中分离得到反式肉桂酸及苯甲酸，并且内生真菌CWJ01经鉴定为波兰青霉（Penicillium polonicum）。本研究可为深入挖掘药用植物内生菌抗菌活性物质提供参考。Abstract: An endophytic fungus CWJ01 with good antibacterial activity was isolated from the leaves of Acanthopanax senticosus. In order to improve the antibacterial activity of the fermentation broth of this strain and explore the substance basis of its antibacterial activity, the fermentation conditions of the endophytic fungus CWJ01 were optimized by orthogonal experiment according the antibacterial activity on the basis of single factor experiments. The secondary metabolites contained in the endophytic fungus CWJ01 were separated by column chromatography. The strains of the endophytic fungus CWJ01 were identified by morphology and ITS sequence analysis. The results showed that the optimum fermentation conditions of CWJ01 were as follows: PDB as the base medium, 2% glucose as the carbon source, 1% peptone as the nitrogen source. The initial pH of the medium was 7.0, the liquid content of the medium was 60%, the inoculated strain was 5%, the rotating speed was 140 r/min, the temperature was 28 ℃, and the culture time was 15 days. Under the optimal process conditions, the diameter of inhibition zone of CWJ01 fermentation broth against Staphylococcus aureus was 27.48±0.17 mm. Trans-cinnamic acid and benzoic acid were isolated from the fermentation broth of endogenous fungus CWJ01, and the endophytic fungus CWJ01 was identified as Penicillium polonicum. This study can provide reference for further exploration of antibacterial active substances of endophytes.
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刺五加为五加科植物刺五加（Acanthopanax seuticosus（Rupr. et Maxim.）Harms）的干燥根、根茎或茎[1]，含有多种苷类成分[2]、黄酮类成分[3]、香豆素[4]、多糖[5]等，具有抗肿瘤[6]、抗抑郁[7]、镇静安神[8]、抗辐射[9]、调节免疫功能[10]、降血糖[11]等多种活性，现广泛应用于食品、药品等领域[12−13]。刺五加需求量逐年上涨，由于森林面积逐渐减少以及盲目的采挖，导致刺五加成为国家二级濒危物种，三级重点保护品种[14]。尽管栽培种植在某种程度上能缓解刺五加原料供应不足的问题，但刺五加的生长周期为3~4年，且栽培种植过程中还存在种质资源变异等问题[15]。因此，采用各种生物技术生产刺五加次生代谢产物原料是目前研究的热点。
内生菌为生长于健康宿主植物组织内部，且不引起宿主植物病变的一类微生物菌群[16]。内生菌与宿主植物之间协同进化，参与宿主植物体内次生代谢产物的生物转化并诱导次生代谢产物的产生[17]，因此，系统研究刺五加内生菌，从刺五加内生菌中筛选具有较好生物活性的目的菌株，并对目的菌株次生代谢产物进行系统性研究具有一定的必要性。尽管已有很多关于刺五加内生菌研究方面的相关报道，但这些研究大多仅限于对刺五加内生菌的分离鉴定工作，而关于刺五加内生菌次生代谢产物系统分离工作的研究却未见报道。本文以分离自健康刺五加叶片的内生真菌CWJ01为研究对象，对其发酵液进行抑菌活性分析，并在此基础上系统研究其抑菌活性物质基础，为刺五加内生菌资源开发及研究提供新思路。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
实验菌株刺五加内生真菌CWJ01 分离自健康刺五加叶，采集地点黑龙江省方正林业局（经度129.533056，纬度45.791111，海拔280.5 m）；PDB、NA培养基 配制方法同文献[18−19]；10受试菌株见表1 购于黑龙江省微生物研究所；引物设计 委托上海生工生物工程股份有限公司合成的ITS通用引物；甲醇、石油醚、乙酸乙酯 天津市富宇精细化工有限公司；氘代氯仿（CDCl3）、氘代甲醇（MeOD） 济南迈纳科技有限公司；链霉素 河北远征药业有限公司；制霉素 佛山市海正药业有限公司；DNA抽提试剂盒 生工生物工程（上海）有限公司。
表 1 实验用受试菌Table 1. Test strains required for the experiments分类 名称 细菌 A金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） B鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baummanii） C大肠杆菌（Escherichia coli） D屎肠球菌（Enterococcus faecium） E短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus） F枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） G铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa） H肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae） I单增李斯特菌（Listeria monocytogenes） 真菌 J白假丝酵母（Candida albicans） FL2000高效液相色谱仪（配紫外检测器） 浙江温岭福立分析仪器有限公司；色谱柱：Venusil XBP-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） Agela Technologeies Inc. USA；SZX超净工作台 南通科学仪器有限公司；HZQ-C空气浴振荡器 哈尔滨东联电子技术开发有限公司；KQ-100DE超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；Waters Xevo TQ-S micro型三重四极杆串联质谱仪 沃特世科技（上海）有限公司（Waters）；400MH固体超导核磁共振波谱AVANCE Ⅲ 美国Thermo Fisher公司。
1.2 实验方法
1.2.1 刺五加内生真菌CWJ01发酵液制备及抑菌活性分析
参阅文献[20]，制备1×107 CFU/mL的刺五加内生真菌CWJ01种子液。以含2%葡萄糖及2%蛋白胨的PDB为培养基，培养基初始pH自然，按装液量为50%（v/v）分装于锥形瓶中。从50 mL种子液中，精密吸取5%（v/v）菌悬液，接种于上述液体培养基中，空气浴振荡器培养条件为28 ℃ 120 r/min，连续培养14 d，培养完成后进行抽滤，将菌丝体滤出，得发酵液，冷冻干燥。取适量冻干粉，加甲醇配制成500 μg/mL的供试品溶液。取供试品溶液、阳性对照溶液（100 μg/mL链霉素和100 μg/mL制霉素），空白对照溶液（甲醇），参阅文献[21]，采用琼脂扩散法检测刺五加内生真菌CWJ01发酵液抗菌活性，采用游标卡尺测量其抑菌圈直径。
1.2.2 刺五加内生真菌CWJ01产抑菌物质发酵工艺的优化
1.2.2.1 单因素实验
在初始pH为7.0的PDB液体培养基中，选取葡萄糖、麦芽糖、蔗糖作为碳源，浓度分别为0%、1%、2%、5%、10%（m/v），取1.2.1中的种子液，按5%的接种量，转接于装液量50%的上述培养基中，其他发酵操作同1.2.1，观察抑菌活性。比较不同浓度的碳源培养基对菌株发酵的影响。
在初始pH为7.0的PDB液体培养基中，选取牛肉膏、蛋白胨、酵母膏作为氮源，浓度分别为0%、0.5%、1%、2%、5%（v/v），接种量、装液量及发酵操作同1.2.1，观察抑菌活性。比较不同浓度的氮源培养基对菌株发酵的影响。
在1.2.1实验基础上，分别探究接种量、装液量、初始pH、转速、温度、发酵时间对抑菌活性的影响。其中接种量分别为：3%、4%、5%、6%、7%、8%（v/v）；装液量为20%、30%、40%、50%、60%、70%（v/v）；初始pH为4、5、6、7、8、9；空气浴振荡器转速分别为：100、120、140、160、180、200 r/min；设定发酵温度分别为：22、24、26、28、30、32 ℃；发酵时间分别为：7、9、11、13、15、17 d，检测发酵液的抑菌活性。
1.2.2.2 正交试验
在单因素实验的基础上，得出最佳单因素实验条件，在4个单因素变化的拐点附近，选取3个水平进行实验，分析碳源浓度（%）、接种量（v/v）、装液量（v/v）、发酵时间（d）四个因素在发酵过程中对刺五加内生真菌CWJ01抑菌活性的影响。以抑菌活性为指标，设计正交试验，优化发酵条件[22−23]。正交试验设计见表2。
表 2 正交试验因素水平Table 2. Factors and levels of orthogonal experiment水平 A碳源浓度（%） B 接种量（%） C 装液量（%） D发酵时间（d） 1 1 4 40 13 2 2 5 50 15 3 5 6 60 17 1.2.3 刺五加内生真菌CWJ01抑菌物质分离
取内生真菌CWJ01发酵液，乙醚萃取3次（3×100 mL），合并萃取液，回收溶剂，得乙醚萃取部位，将乙醚萃取部位通过硅胶柱分离，以石油醚:乙酸乙酯（15:5）为洗脱液，收集洗脱液（10 mL/组分），以石油醚:乙酸乙酯（15:5）为展开剂进行薄层层析（TLC）检识后，合并20～50号组分，回收溶剂后，再次进行硅胶柱分离，以石油醚:乙酸乙酯（15:10）为洗脱液，收集洗脱液（5 mL/组分），以石油醚:乙酸乙酯（15:10）为展开剂进行TLC检识后，合并78～85号组分，得到的粗结晶于4 ℃冷藏48 h后，得到晶体A；继续收集120～130号组分，得到粗结晶混合物，将此粗结晶混合物以石油醚:乙酸乙酯（15:15）为洗脱液进行硅胶柱（柱内径22 mm，柱长300 mm）纯化，收集洗脱液（5 mL/组分），以石油醚:乙酸乙酯（15:15）为展开剂进行TLC检识后，合并50～58号组分，回收溶剂后于4 ℃冷藏24 h，析出晶体B，晶体A和B的抑菌活性分析同1.2.1。
1.2.4 刺五加内生真菌CWJ01抑菌物质结构鉴定
采用HPLC法，分别以a.甲醇:水:甲酸（60:40:0.5），检测波长254 nm；b.乙腈:水:甲酸（65:34:1），检测波长260 nm为流动相（流速：1 mL·min−1）；色谱柱：Global Chromatography-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：25 ℃；进样量：10 μL；洗脱时间：60 min，对所分离得到的晶体A及B（0.5 mg/mL）进行纯度测定并采用质联（MS）电喷雾电离（ESI）对晶体A和晶体B进行正、负离子扫描[24]；同时根据晶体A及B的理化性质分别采用CDCl3及MeOD溶解后（0.1 mg/mL）进行核磁共振（1H-NMR及13C-NMR）鉴定[25]。
1.2.5 刺五加内生真菌CWJ01的鉴定
采用形态学观察及分子生物学鉴定（ITS序列分析）法[24−25]，对刺五加内生真菌CWJ01菌株进行鉴定。
1.2.5.1 刺五加内生真菌CWJ01菌株形态学初步鉴定
对刺五加内生真菌CWJ01进行菌株形态观察、光学显微镜和扫描电子显微镜观察，观察菌株菌落在培养基的长势特征及正反面颜色，在显微形态下观察菌株的孢子和孢子梗形态，并且比照文献《真菌分类学》[26]《真菌鉴定手册》[27]，对该菌做形态学初步分类。
1.2.5.2 刺五加内生真菌CWJ01菌株分子生物学鉴定
a.刺五加内生真菌CWJ01基因组DNA的提取：用上海生物工程有限公司Ezup柱式真菌的基因组抽提试剂盒对CWJ01菌株的基因组DNA进行提取，步骤为：菌株活化：将CWJ01菌株接种于PDA培养基上，28 ℃，培养3 d，备用。菌丝体的制备：活化后的CWJ01菌种转接于马铃薯液体培养基，于28 ℃，140 r/min摇床培养3 d，取出，抽滤，所得的菌体分别用25%乙醇和灭菌ddH2O先后处理2次，离心，弃上清，冷冻干燥，置于4 ℃保藏。50 mg CWJ01菌体，与适量液氮混合，并迅速研磨使其完全呈粉末，将菌粉置于灭菌的tube管中，依次添加65 ℃的FPCB Solution 700 μL和β-巯基乙醇7 μL充分振荡使其混合均匀，60 ℃水浴25 min。室温放置10 min，加入苯酚：氯仿：异丙醇（25:24:1）混合溶液700 μL，轻摇10次，于4 ℃ 12000 r/min离心5 min。将上清转移至2 mL事先灭菌的tube管中，小心添加700 μL氯仿摇匀，于5 ℃ 12000 r/min离心4 min。上清液添加40 μL RNase A（20 mg/mL），充分混匀，于室温放置8 min后，分别依次加入一半体积BD Buffer试剂，充分振荡使其混匀。将上一步中混合物移至吸附柱内，静置2 min，10000 r/min离心1 min，弃去管中液体。将吸附柱放回收集管中，加入500 μL PW Solution，10000 r/min离心1 min，弃去废液。再将吸附柱放回收集管中，加入500 μL Wash Solution，10000 r/min离心1 min，弃废液，10000 r/min 再次离心3 min。最后将吸附柱转移至无菌tube内，添加50 μL 60 ℃的Elution Buffer试剂，室温下放置3~5 min，调节转速10000 r/min 离心2 min后，获得CWJ01菌株的DNA溶液，−20 ℃保藏。
b.目的片段的PCR扩增：采用真菌通用引物扩增ITS rDNA片段，引物是由上海生物工程有限公司合成的真菌ITS rDNA序列通用引物ITS1、ITS4，其序列如下所示：正向引物ITS1：（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）；反向引物ITS4：（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。PCR反应体系见表3，反应程序见表4。
表 3 PCR反应体系Table 3. Components of PCR reaction试剂 体积（μL） Template（基因组DNA 20~50 ng/μL） 0.5 10×Buffer（with Mg2+） 2.5 dNTP（各2.5 mmol/L） 1.0 酶 0.2 F（10 Um） 0.5 R（10 Um） 0.5 加dd H2O至 25 表 4 PCR循环条件Table 4. Amplification procedure of PCR温度（℃） 时间 程序 94 4 min 预变性 94 45 s
30 cycle55 45 s 72 1 min 72 10 min 修复延伸 4 ∞ 终止反应 PCR产物检测：扩增产物用凝胶电泳（含1%的琼脂糖）检测，利用UVP凝胶成像系统采集，并分析扩增图谱，150 V、100 mA、20 min电泳观察。
c.纯化回收PCR产物：回收电泳检测出的CWJ01菌株的DNA目的片段，其反应程序如下：切割目的产物，称重后再加入5倍的Buffer B2，于50 ℃条件下水浴8 min。调节转速8000 r/min离心40 s。倒掉收集管中液体。加入500 μL Wash Solution，9000×g离心30 s，倒掉收集管中液体。重复上述步骤一次。空吸附柱于9000×g离心1 min。吸附柱置于无菌tube内，小心添加30 μL Elution Buffer，放置2 min，再次离心1 min，4 ℃保存含有DNA的溶液。
d.测序：将获得的目的DNA片段送至上海生工生物工程有限公司进行CWJ01菌株的后续测序。
e.系统进化分析：将CWJ01菌种的ITS rDNA核苷酸序列上传至NCBI数据库，在GenBank中与其他已知序列进行比对，然后通过MEGA5.0软件构建刺五加内生真菌CWJ01菌株的系统发育树，分析其亲缘关系和进化过程，从而进一步确定菌株的科属。
1.3 数据处理
上述实验均重复3次，使用Origin Lab进行数据分析，采用SPSS 25进行单因素方差分析（ANOVA）及相关性性分析；采用IBM SPSS Statistics 26对数据结果进行正交设计及分析。
2. 结果与分析
2.1 刺五加内生真菌CWJ01抑菌活性分析
刺五加内生真菌CWJ01发酵液对10种受试菌均表现出不同程度的抑制作用，具体抑菌活性结果见表5。
表 5 内生真菌CWJ01发酵液的抑菌作用（n=3）Table 5. Antimicrobial activities of fermentation broth of endophytic fungi CWJ01 (n=3)样品 抑菌圈直径（mm） A B C D E F G H I J CWJ01发酵液 20.16±0.07 17.28±0.25 19.70±0.33 12.93±0.63 16.00±0.15 15.83±0.59 13.74±0.47 15.66±0.76 12.63±0.05 10.21±0.55 空白对照（甲醇） − − − − − − − − − − 阳性对照（链霉素） 20.82±0.25 26.12±0.23 28.19±0.27 24.00±0.08 20.55±0.66 26.21±0.11 28.07±0.46 26.66±0.41 23.21±0.33 − 阳性对照（制霉素） − − − − − − − − − 21.00±0.39 注：受试菌A～J名称见表1；−无抑菌活性；表8同。 结果表明，目的菌株发酵液对上述10种致病菌均有抑制作用，但在此抑菌浓度下，其抑菌活性弱于阳性对照品溶液（链霉素），后续可通过提高抑菌浓度的方式增强其抑菌活性。此外，通过抑菌活性分析可以看出，刺五加内生真菌CWJ01对金黄色葡萄球菌抑制作用最为明显，其抑菌活性与阳性对照品溶液相近，抑菌圈直径达到了20.16±0.07 mm，因此选取金黄色葡萄球菌作为指示菌筛选刺五加内生真菌CWJ01的发酵工艺条件。
2.2 发酵工艺的优化
2.2.1 单因素实验结果
2.2.1.1 培养基碳源及其含量对发酵工艺的影响
采用含有不同质量浓度碳源的培养基对刺五加内生真菌CWJ01进行培养，随后进行抑菌活性测定，结果见图1。
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图 1 碳源及其含量对CWJ01发酵液抑菌活性的影响注：D：当质量浓度为2%时，3种碳源对CWJ01发酵液抑菌活性的影响；图中不同小写字母表示抑菌活性存在显著差异（P<0.05），图2同。Figure 1. Effect of carbon source and its content on antibacterial activity of CWJ01 fermentation broth由图1可知，当培养基中含有不同质量浓度的碳源时，对CWJ01发酵液的抑菌活性存在显著差异（P<0.05），当3种培养基中碳源质量浓度低于2%时，均不能满足菌株CWJ01的正常生长发育及代谢；而当碳源浓度高于2%时，高浓度的碳源可能使菌株CWJ01生长过快，多种次生代谢产物快速积累，以致使其抑菌活性次生代谢产物浓度被稀释，从而使其抑菌活性出现降低的趋势[18]。此外，当3种培养基中碳源质量浓度为2%时，CWJ01发酵液的抑菌活性较强，尤其是当培养基中碳源为2%葡萄糖时，其抑菌活性最强。因此选择葡糖糖为最优碳源。
2.2.1.2 培养基氮源及其含量对发酵工艺的影响
采用含有不同质量浓度氮源的培养基对刺五加内生真菌CWJ01进行培养，随后进行抑菌活性测定，结果见图2。
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图 2 氮源及其含量对CWJ01发酵液抑菌活性的影响注：D：当质量浓度为1%时，3种氮源对CWJ01发酵液抑菌活性的影响。Figure 2. Effect of nitrogen source and its content on antibacterial activity of CWJ01 fermentation broth由图2可以看出，当培养基中不含氮源（氮源质量浓度0%）及含有0.5%、1%的氮源时，对CWJ01发酵液的抑菌活性存在一定影响，这可能是由于当培养基中氮源质量浓度低于1%时，菌株CWJ01生长发育会出现缓慢现象，从而使其抑菌活性次生代谢产物合成减少；而当培养基中含有1%、2%、5%的氮源时，对CWJ01发酵液的抑菌活性基本无影响。此外，当3种培养基中氮源质量浓度为1%时，CWJ01发酵液的抑菌活性较强，尤其是当培养基中氮源为1%蛋白胨时，其抑菌活性最强。因为氮源影响较小，根据上述实验结果确定选择1%蛋白胨为氮源。
2.2.1.3 菌株接种量对发酵工艺的影响
菌株接种量过大或者过小均会对刺五加内生真菌CWJ01的发酵产生影响，不同菌株接种量下其抑菌活性结果如图3所示。
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图 3 不同菌株接种量对刺五加内生真菌CWJ01发酵液抑菌活性影响Figure 3. Antibacterial activities of CWJ01 fermentation broth at different inoculation quantities结果表明，随着菌株接种量从3%增加到8%，刺五加内生真菌CWJ01的抑菌活性呈现先增强后减弱的趋势。上述结果说明，接种量持续增加并不能使其抑菌活性持续增强，反而因单位容积内菌种浓度过大使培养基中营养物质过度消耗而阻碍了其生长发育，从而使其次生代谢产物合成缓慢，进而影响了其抑菌活性[28]。
2.2.1.4 培养基装液量对发酵工艺的影响
分别测定不同的装液量（v/v）对刺五加内生真菌CWJ01抑菌活性的影响，结果如图4。
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图 4 培养基装液量对刺五加内生真菌CWJ01发酵液抑菌活性的影响Figure 4. Antibacterial activities of CWJ01 fermentation broth at different fermentation volumns结果表明，装液量会直接影响刺五加内生真菌CWJ01的生长发育，培养基装液量既不可以过低，也不可以过多，装液量为50%时，CWJ01抑菌活性最强。培养基装液量过低，意味着其营养物质达不到菌株正常生长发育的需求；装液量过高，则会稀释菌株的次生代谢产物浓度，从而出现其抑菌活性减弱的现象[29]。
2.2.1.5 培养基初始pH对发酵工艺的影响
分别采用不同初始pH的培养基对刺五加内生真菌CWJ01进行培养，培养后测定其抑菌活性，结果见图5。
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图 5 培养基初始pH对刺五加内生真菌CWJ01发酵液抑菌活性影响Figure 5. Antibacterial activities of CWJ01 fermentation broth at different initial pH结果表明，初始pH能影响发酵液的黏度，并对次生代谢产物的稳定性也产生影响，当pH为4.0时，抑菌活性较低，可能是因为发酵液酸度过强，影响了菌体生长，导致抗菌活性物质产生较少，当初始pH从5.0上升至7.0时，其抑菌效果也随之增加，并且当初始pH达到7.0时，其活性最强，随后，随着初始pH的继续增大，活性作用逐渐降低，原因可能是发酵液碱性过大，影响菌体生长导致抗菌物质产生受到抑制。因此，确定最佳初始pH为7.0。上述结果证明，培养基的初始pH对目的菌株抑菌活性有显著影响。因菌株生长过程中能够分泌代谢产物主动调节pH，故以初始pH为7进行后续实验。
2.2.1.6 空气浴振荡器转速对发酵工艺的影响
分别设置空气浴振荡器不同的转速，观察转速对刺五加内生真菌CWJ01抑菌活性的影响，结果见图6。
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图 6 不同转速对刺五加内生真菌CWJ01发酵液抑菌活性的影响Figure 6. Antibacterial activities of CWJ01 fermentation broth at different speeds of shaking speed结果表明，空气浴振荡器转速能够影响刺五加内生真菌CWJ01的抑菌活性。仪器转动过程中能够将刺五加内生真菌CWJ01与培养基充分接触，保证其在生长发育过程中接触到新鲜的营养物质。然而转速过高，将产生较大的摩擦力，容易导致菌株变形或死亡[30]。上述结果表明，空气浴振荡器转速为140 r/min时，发酵液的抑菌活性最强。因空气浴振荡器的转速增加过程中会间接导致温度变化，故以140 r/min为最终条件进行后续实验研究。
2.2.1.7 空气浴振荡器振荡温度设置对发酵工艺的影响
分别设置不同的空气浴振荡器温度进行目的菌株发酵，筛选刺五加内生真菌CWJ01的最适生长温度，结果见图7。
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图 7 发酵温度对刺五加内生真菌CWJ01发酵液抑菌活性影响Figure 7. Antibacterial activities of CWJ01 fermentation broth at different fermentation temperatures结果表明，温度对刺五加内生真菌CWJ01的生长发育有较明显的影响，刺五加内生真菌CWJ01的最适发酵温度为28 ℃。当温度低于28 ℃，其酶活性未被完全激活，从而使其次生代谢产物的合成缓慢；而当温度高于28 ℃，其酶的活性也可能被抑制，从而使其次生代谢产物合成较少，进而使抑菌活性降低[31]。
2.2.1.8 发酵时间对发酵工艺的影响
分别对刺五加内生真菌CWJ01进行不同时间的发酵，不同发酵时间下目的菌株抑菌活性结果见图8。
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图 8 发酵时间对刺五加内生真菌CWJ01发酵液抑菌活性影响Figure 8. Antibacterial activities of CWJ01 fermentation broth at different fermentation time结果表明，在7~15 d，刺五加内生真菌CWJ01的抑菌活性随着发酵时间的增长而增强，但随着发酵时间超过15 d后，菌株可能进入衰老期，其抑菌活性开始减弱，因此，发酵时间15 d是该单因素实验的拐点，此时抑菌效果最好，当不足或超过15 d后，抑菌效果均下降。
2.2.2 正交试验结果
正交试验及方差分析结果见表6、表7。通过极差分析及方差分析（见表6及表7）可知，对刺五加内生真菌CWJ01发酵液抑菌能力影响较大的四个因素顺序为C>B>A>D，以抑菌活性为指标，刺五加内生真菌CWJ01最优发酵组合为：A2B2C3D2，即培养基中以2%葡萄糖为碳源，5%（v/v）菌种接种量，60%（v/v）的培养基装液量，发酵时间为15 d。综合考虑发酵过程中各因素的影响，最终确定刺五加内生真菌CWJ01的最佳发酵工艺为：基础培养基为PDB，其中碳源为2%葡萄糖；氮源为1%蛋白胨；培养基初始pH为7.0；培养基装液量为60%（v/v）；菌株接种量为5%（v/v）；将已接种的刺五加内生真菌CWJ01置于空气浴振荡器，仪器参数设置为：振动频率（转速）140 r/min；温度设置28 ℃；连续培养15 d。
表 6 正交试验结果Table 6. Results of orthogonal experiment试验号 因 素 抑菌圈直径
（mm）A（碳源浓度） B（接种量） C（装液量） D（发酵时间） 1 1 1 1 1 19.20±0.21 2 1 2 2 2 27.31±0.35 3 1 3 3 3 25.72±0.30 4 2 1 2 3 22.40±0.72 5 2 2 3 1 26.60±0.01 6 2 3 1 2 24.00±0.21 7 3 1 3 2 23.31±0.22 8 3 2 1 3 20.32±0.46 9 3 3 2 1 23.00±0.35 K1 72.23 64.91 63.52 68.80
ΣY=211.86
CT=4987.18K2 73.00 74.23 72.71 74.62 K3 66.63 72.72 75.63 68.44 R 2.123 3.107 4.037 2.060 S 8.063 16.69 26.63 8.026 注：ΣY表示组别1~9抑菌圈直径之和；CT=（ΣY2）/9。 表 7 方差分析结果Table 7. Results of variance analysis方差来源 偏差平方和 自由度 均方 F值 显著性 A 8.063 2 4.032 806.4 ** B 16.69 2 8.345 1669 ** C 26.63 2 13.315 2663 ** D 8.026 2 4.013 802.6 ** 误差 0.01 2 0.005 注：**P<0.01，表示差异极显著。 为了验证所筛选发酵工艺参数的合理性，采用上述最佳发酵工艺制备刺五加内生真菌CWJ01的发酵液后对其进行抑菌实验，结果表明，经优化后的发酵条件制备的刺五加内生真菌CWJ01的发酵液抑菌活性可达27.48±0.17 mm，而采用1.2.1方法制备的刺五加内生真菌CWJ01的发酵液抑菌活性为20.16±0.07 mm，上述结果说明了工艺筛选的合理性。
2.3 刺五加内生真菌CWJ01抑菌物质的分离
为了阐明刺五加内生真菌CWJ01抑菌活性物质基础，对刺五加内生真菌CWJ01发酵液中次生代谢产物进行提取分离，结果从刺五加内生真菌CWJ01的发酵液中分离得到2个单体化合物，其抑菌作用结果见表8。
表 8 晶体A和B抑菌活性结果（n=3）Table 8. Antibacterial activity results of crystals A and B (n=3)样品 抑菌圈直径（mm） A B C D E F G H I J 结晶A（100 μg/mL） 17.28±0.30 18.27±0.37 8.56±0.15 26.89±0.33 18.37±0.36 17.25±0.32 − 8.36±0.13 − − 结晶B（100 μg/mL） 8.75±0.66 − − 28.00±0.61 − 8.79±0.39 18.2±0.2 8.75±0.36 17.32±0.43 − 空白对照（甲醇） − − − − − − − − − − 阳性对照（链霉素） 24.00±0.11 26.80±0.61 25.40±0.37 28.11±0.01 22.05±0.09 23.30±0.45 23.06±0.29 27.88±0.65 23.50±0.45 − 阳性对照（制霉素） − − − − − − − − − 21.90±0.59 由表8可知，晶体A及晶体B均有较好的抑菌活性，二者均为刺五加内生真菌CWJ01发酵液中的抑菌活性物质。
单体物质A：白色针晶，mp.59~62 ℃。ESI-MS m/z: 146 [M-2H]-，295 [2M-H]-，443 [3M-H]-，579 [4M-H]-，结果如图9所示。1H-NMR（400 MHz，MeOD）δ 7.59（d，J=16.0 Hz，1H），7.22（t，J=7.9 Hz，1H），7.05（d，J=7.7 Hz，1H），6.99（t，J=2.1 Hz，1H），6.83（dd，J=8.1，2.5 Hz，1H），6.41（d，J=16.0 Hz，1H），结果如图10所示。13C-NMR（101 MHz，MeOD）δ 49.32（dd，J=42.8，21.5 Hz），48.79，48.57，48.36，结果如图11所示。
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图 10 单体物质A的 1H-NMR核磁共振谱Figure 10. 1H-NMR nuclear magnetic resonance spectrum of crystal A![]()
图 11 单体物质A 的13C-NMR核磁共振谱Figure 11. 13C-NMR nuclear magnetic resonance spectrum of crystal A综合HPLC、MS、1H-NMR以及13C-NMR鉴定可知，单体物质A相对分子质量为148.16，分子式为C9H8O2，元素分析结果为C：88.47，H：6.60，O：26.27，同时结合其理化性质，以及参阅文献[32]，最终确定单体物质A为反式肉桂酸，其结构如图12所示。
单体物质B：淡黄色针状结晶。MS鉴定结果：Positive MS：145.2 [M+Na]+，267.3 [2M+Na]+，283.4 [2M+k]+，Negetive MS：121.3 [M-H]-，结果如图13所示。1H-NMR（400 MHz，MeOD）δ 8.06（2H，d，J=7.8Hz，H-2，6），7.62（1H，dt，J=7.4，1.3Hz，H-4），7.50（2H，t，J=7.2Hz，H-3，5），为苯环上单取代，1个氢原子被羟基取代。结果如图14所示。13C-NMR（100 MHz，MeOD）δ 131.8（C-1），130.7（C-2，6），129.5（C-3，5）134.0（C-4），170.0（C-COOH）结果如图15所示。
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图 14 单体物质B的 1H-NMR核磁共振谱Figure 14. 1H-NMR nuclear magnetic resonance spectrum of crystal B![]()
图 15 单体物质B的 13C-NMR核磁共振谱Figure 15. 13C-NMR nuclear magnetic resonance spectrum of crystal B根据MS以及13C-NMR，1H-NMR鉴定，单体物质B相对分子质量为122.12，分子式为C7H6O2 ，元素分析结果为C：68.81，H：4.95，O：26.27，同时结合其理化性质，以及参阅文献[33]，最终确定单体物质B为苯甲酸，其结构如图16所示。
从刺五加内生真菌CWJ01发酵液中分离得到反式肉桂酸及苯甲酸，其中，作为重要的有机酸，反式肉桂酸具有抑菌、抗氧化等作用，且安全、无毒，即可做水果防腐剂，也可做调味料[34]；苯甲酸可以作为防腐剂广泛应用于食品中（GB2760-2014）。刺五加内生真菌CWJ01发酵液的抑菌作用可能为其所含上述2种次生代谢产物共同作用的结果，后续将对其具有抑菌活性的次生代谢产物进行更为系统的分离。
2.4 刺五加内生真菌CWJ01的鉴定
刺五加内生真菌CWJ01菌落为青绿色，菌丝密集，背面基质为深黄色；孢子大小相近，单个孢子呈圆粒形、卵圆形和椭圆形，光滑，孢子大都聚集在孢子梗顶部呈伞形，其菌落形态及显微形态见图17。
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图 17 内生真菌CWJ01菌落形态及孢子显微形态结构Figure 17. Colony morphology and the spore microstructure of endophytic fungi CWJ01从刺五加内生真菌CWJ01 DNA中获得1条长度为560 bp的特异性条带（见图18），根据其ITS序列建立刺五加内生真菌CWJ01的系统发育树（如图19），目的菌株序列与Penicillium polonicum（LC092114.1）的相似性达到了99%，结合形态学观察结果，将刺五加内生真菌CWJ01菌株鉴定为波兰青霉（Penicillium polonicum）。
3. 结论
从健康刺五加叶中分离得到一株可以产刺五加苷E的内生真菌CWJ01，该菌株发酵液同时也具有较好的抗菌活性，为提高其抑菌活性，对其发酵工艺参数进行优化后，确定其最适发酵条件为：基础培养基PDB中碳源是2%葡萄糖，氮源是1%蛋白胨，培养基初始pH7.0，培养基装液量60%（v/v），菌悬液接种量5%（v/v），摇床转速140 r/min，培养温度28 ℃。连续培养时间15 d。发酵条件优化后所制备的内生真菌CWJ01发酵液，其抑菌活性较未经发酵条件筛选所制备的发酵液抑菌活性显著提高；从内生真菌CWJ01发酵液中分离得到2种具有抑菌活性的物质反式肉桂酸及苯甲酸。经鉴定，内生真菌CWJ01为波兰青霉（Penicillium polonicum）。上述结果可为构建工程菌株及开发应用刺五加内生真菌CWJ01提供参考。
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图 1 碳源及其含量对CWJ01发酵液抑菌活性的影响
注：D：当质量浓度为2%时，3种碳源对CWJ01发酵液抑菌活性的影响；图中不同小写字母表示抑菌活性存在显著差异（P<0.05），图2同。
Figure 1. Effect of carbon source and its content on antibacterial activity of CWJ01 fermentation broth
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图 2 氮源及其含量对CWJ01发酵液抑菌活性的影响
注：D：当质量浓度为1%时，3种氮源对CWJ01发酵液抑菌活性的影响。
Figure 2. Effect of nitrogen source and its content on antibacterial activity of CWJ01 fermentation broth
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图 3 不同菌株接种量对刺五加内生真菌CWJ01发酵液抑菌活性影响
Figure 3. Antibacterial activities of CWJ01 fermentation broth at different inoculation quantities
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图 4 培养基装液量对刺五加内生真菌CWJ01发酵液抑菌活性的影响
Figure 4. Antibacterial activities of CWJ01 fermentation broth at different fermentation volumns
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图 5 培养基初始pH对刺五加内生真菌CWJ01发酵液抑菌活性影响
Figure 5. Antibacterial activities of CWJ01 fermentation broth at different initial pH
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图 6 不同转速对刺五加内生真菌CWJ01发酵液抑菌活性的影响
Figure 6. Antibacterial activities of CWJ01 fermentation broth at different speeds of shaking speed
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图 7 发酵温度对刺五加内生真菌CWJ01发酵液抑菌活性影响
Figure 7. Antibacterial activities of CWJ01 fermentation broth at different fermentation temperatures
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图 8 发酵时间对刺五加内生真菌CWJ01发酵液抑菌活性影响
Figure 8. Antibacterial activities of CWJ01 fermentation broth at different fermentation time
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图 10 单体物质A的 1H-NMR核磁共振谱
Figure 10. 1H-NMR nuclear magnetic resonance spectrum of crystal A
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图 11 单体物质A 的13C-NMR核磁共振谱
Figure 11. 13C-NMR nuclear magnetic resonance spectrum of crystal A
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图 14 单体物质B的 1H-NMR核磁共振谱
Figure 14. 1H-NMR nuclear magnetic resonance spectrum of crystal B
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图 15 单体物质B的 13C-NMR核磁共振谱
Figure 15. 13C-NMR nuclear magnetic resonance spectrum of crystal B
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图 17 内生真菌CWJ01菌落形态及孢子显微形态结构
Figure 17. Colony morphology and the spore microstructure of endophytic fungi CWJ01
表 1 实验用受试菌
Table 1 Test strains required for the experiments
分类 名称 细菌 A金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） B鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baummanii） C大肠杆菌（Escherichia coli） D屎肠球菌（Enterococcus faecium） E短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus） F枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） G铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa） H肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae） I单增李斯特菌（Listeria monocytogenes） 真菌 J白假丝酵母（Candida albicans） 
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表 2 正交试验因素水平
Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment
水平 A碳源浓度（%） B 接种量（%） C 装液量（%） D发酵时间（d） 1 1 4 40 13 2 2 5 50 15 3 5 6 60 17
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表 3 PCR反应体系
Table 3 Components of PCR reaction
试剂 体积（μL） Template（基因组DNA 20~50 ng/μL） 0.5 10×Buffer（with Mg2+） 2.5 dNTP（各2.5 mmol/L） 1.0 酶 0.2 F（10 Um） 0.5 R（10 Um） 0.5 加dd H2O至 25
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表 4 PCR循环条件
Table 4 Amplification procedure of PCR
温度（℃） 时间 程序 94 4 min 预变性 94 45 s
30 cycle55 45 s 72 1 min 72 10 min 修复延伸 4 ∞ 终止反应
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表 5 内生真菌CWJ01发酵液的抑菌作用（n=3）
Table 5 Antimicrobial activities of fermentation broth of endophytic fungi CWJ01 (n=3)
样品 抑菌圈直径（mm） A B C D E F G H I J CWJ01发酵液 20.16±0.07 17.28±0.25 19.70±0.33 12.93±0.63 16.00±0.15 15.83±0.59 13.74±0.47 15.66±0.76 12.63±0.05 10.21±0.55 空白对照（甲醇） − − − − − − − − − − 阳性对照（链霉素） 20.82±0.25 26.12±0.23 28.19±0.27 24.00±0.08 20.55±0.66 26.21±0.11 28.07±0.46 26.66±0.41 23.21±0.33 − 阳性对照（制霉素） − − − − − − − − − 21.00±0.39 注：受试菌A～J名称见表1；−无抑菌活性；表8同。
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表 6 正交试验结果
Table 6 Results of orthogonal experiment
试验号 因 素 抑菌圈直径
（mm）A（碳源浓度） B（接种量） C（装液量） D（发酵时间） 1 1 1 1 1 19.20±0.21 2 1 2 2 2 27.31±0.35 3 1 3 3 3 25.72±0.30 4 2 1 2 3 22.40±0.72 5 2 2 3 1 26.60±0.01 6 2 3 1 2 24.00±0.21 7 3 1 3 2 23.31±0.22 8 3 2 1 3 20.32±0.46 9 3 3 2 1 23.00±0.35 K1 72.23 64.91 63.52 68.80
ΣY=211.86
CT=4987.18K2 73.00 74.23 72.71 74.62 K3 66.63 72.72 75.63 68.44 R 2.123 3.107 4.037 2.060 S 8.063 16.69 26.63 8.026 注：ΣY表示组别1~9抑菌圈直径之和；CT=（ΣY2）/9。
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表 7 方差分析结果
Table 7 Results of variance analysis
方差来源 偏差平方和 自由度 均方 F值 显著性 A 8.063 2 4.032 806.4 ** B 16.69 2 8.345 1669 ** C 26.63 2 13.315 2663 ** D 8.026 2 4.013 802.6 ** 误差 0.01 2 0.005 注：**P<0.01，表示差异极显著。
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表 8 晶体A和B抑菌活性结果（n=3）
Table 8 Antibacterial activity results of crystals A and B (n=3)
样品 抑菌圈直径（mm） A B C D E F G H I J 结晶A（100 μg/mL） 17.28±0.30 18.27±0.37 8.56±0.15 26.89±0.33 18.37±0.36 17.25±0.32 − 8.36±0.13 − − 结晶B（100 μg/mL） 8.75±0.66 − − 28.00±0.61 − 8.79±0.39 18.2±0.2 8.75±0.36 17.32±0.43 − 空白对照（甲醇） − − − − − − − − − − 阳性对照（链霉素） 24.00±0.11 26.80±0.61 25.40±0.37 28.11±0.01 22.05±0.09 23.30±0.45 23.06±0.29 27.88±0.65 23.50±0.45 − 阳性对照（制霉素） − − − − − − − − − 21.90±0.59
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